李曉娟　賀順堯(河南省南陽(yáng)胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，南陽(yáng)473000)

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安石榴甙對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

李曉娟賀順堯①(河南省南陽(yáng)胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，南陽(yáng)473000)

［摘要］目的:探討安石榴甙在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中的保護(hù)作用。方法:腹腔注射20 mg/kg體重的LPS(脂多糖)制備ALI(急性肺損傷)小鼠模型，誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷。隨機(jī)將60只小鼠分為6組，每組10只:正常對(duì)照組，LPS組，LPS+安石榴甙組(10、20、40 mg/kg體重)，LPS+地塞米松組。安石榴甙和地塞米松均在注射LPS前2 h腹腔注射給藥，然后小鼠再腹腔注射致死量的LPS，正常對(duì)照組小鼠只給予腹腔注射等體積的PBS。HE染色，觀察小鼠肺組織在不同處理?xiàng)l件下的病理變化和肺損傷程度;稱量小鼠濕肺、干肺重量，觀察小鼠的肺水腫程度;檢查肺組織勻漿中的MPO(髓過(guò)氧化物酶活性)活性情況，分析中性粒細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)情況;計(jì)數(shù)肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和炎癥細(xì)胞的數(shù)量，ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子的濃度，分析安石榴甙對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果:小鼠肺組織HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫和肺實(shí)質(zhì)的損傷均明顯減輕。不同劑量的安石榴甙可以顯著減低ALI小鼠中濕肺/干肺重量比(P＜0.05)。說(shuō)明安石榴甙可以減輕ALI導(dǎo)致的肺組織滲出、水腫。不同劑量的安石榴甙可以顯著減少肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量(P＜0.05)。安石榴甙可明顯降低肺泡灌洗液中的細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的濃度(P＜0.05)。MPO的活性檢測(cè)表明，安石榴甙減少了LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞在肺組織中的浸潤(rùn)。結(jié)論:安石榴甙在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中具有明顯的保護(hù)作用。

［關(guān)鍵詞］安石榴甙;脂多糖;急性肺損傷

①河南省南陽(yáng)市南陽(yáng)胸科醫(yī)院彩超室，南陽(yáng)473000。

Protective effects of pomegranate glycosides on LPS-induced acute lung injury to mice

LI Xiao-Juan，HE Shun-Yao.Clinical Laboratory，Nanyang Chest Hospital，Nanyang 473000，China

［Abstract］Objective: To investigate the protective effect of punicalagin in LPS induced ALI.Methods: ALI mice model was induced by intraperitoneal injection of LSP(20 mg/kg bodyweight) to induce acute lung injury in mice.A total of 60 mice were divided into 6 groups，10 rats in each group: normal control group，LPS group，LPS+ punicalagin group (10，20，40 mg/kg bodyweight)，LPS+ dexamethasone group.2 h before LPS injection，punicalagin and dexamethasone were intraperitoneal injection in mice，and then by intraperitoneal injection of a lethal dose of LPS，normal control group mice were given intraperitoneal injection of an equal volume of PBS.HE staining，observed the lung tissue of mice in the different treatment conditions of the pathological changes and the degree of lung injury，weighted the wet lung and dry lung of the mice respectively，observed degree of pulmonary edema in mice，inspect MPO activity of lung homogenate，analyzed the activation and infiltration of polymorphonuclear，counted the total number of cells and the number of inflammatory cells in alveolar lavage fluid，detected the concentration of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid with ELISA，and analyzed the impact of punicalagin on inflammation of lung tissue.Results: HE staining of lung tissue in mice and found that the LPS-induced lung inflammatory cell infiltration，interstitial edema and pulmonary parenchymal damage were significantly reduced.Different dose of punicalagin could significantly reduce the lung wet/dry lung weight ratio of ALI in mice (P＜0.05) .Punicalagin ALI could reduce lung tissue caused exudation，edema.The different doses of punicalagin could significantly reduce the inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid，the sum of the number of neutrophils and macrophages (P＜0.05) .Punicalagin could significantly reduce the concentration in the bronchoalveolar lavage cytokines IL-6，IL-12，TNF-α and IL-1β(P＜0.05) .The MPO activity was detected that punicalagin reduce neutrophil infiltration induced by LPS in the lung tissue.Conclusion: Punicalagin has protective effects on LPS induced acute lung injury.

［Key words］Punicalagin; Lipopolysaccharide; Acute lung injury

急性肺損傷是由于心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，臨床上是以非心源性肺水腫和頑固性低氧血癥為特征的一種綜合征［1］。急性肺損傷作為一種嚴(yán)重的疾病仍然具有30%～40%的死亡率，若伴有膿毒癥病死率高達(dá)90%［2，3］。截至目前報(bào)道，急性肺損傷若同時(shí)并發(fā)4個(gè)以上臟器功能障礙，則病死率為100%［4，5］。因此，探索治療急性肺損傷的有效措施和特效藥物是非常必要和迫切的。安石榴甙是從石榴科植物中提取的一種多酚類活性成分。近幾年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，安石榴甙具有很強(qiáng)的抗氧化、抗增殖和抑制腫瘤的作用，以及對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗炎癥功能［6-8］。在原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，安石榴甙抑制了LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［9］。安石榴甙可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，那么是否可以將其用于LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的治療目前還不清楚。本研究就是通過(guò)應(yīng)用安石榴甙治療LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，觀察安石榴甙在急性肺損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1試劑耗材安石榴甙(＞89%)購(gòu)自北京寰宇科創(chuàng)生物公司，LPS(Escherichia coli O55: B5)購(gòu)自Sigma公司，細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒，髓過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司。

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡BALB/c小鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ALI小鼠模型的制備隨機(jī)將60只BALB/ c小鼠分為6組，每組10只:正常對(duì)照組，LPS組，LPS+安石榴甙組(10、20、40 mg/kg體重)，LPS+地塞米松組。安石榴甙和地塞米松均在注射LPS前2 h腹腔注射給藥，然后小鼠再腹腔注射致死量的LPS(20 mg/kg體重)誘導(dǎo)急性肺損傷。正常對(duì)照組小鼠只給予腹腔注射等體積的PBS。LPS注射7 h后，處死小鼠，解剖小鼠取肺臟，收集小鼠支氣管肺泡灌洗液。

1.2.2肺組織滲出程度檢測(cè)(濕肺/干肺重量比)

(1)斷頸處死小鼠，解剖小鼠，分離獲取小鼠肺臟。(2)稱重記錄每只小鼠左肺濕肺重量。(3)然后，將左肺置于80℃烤箱內(nèi)烘烤48 h，直至肺臟完全失去水分，稱重獲得干肺重量。(4)計(jì)算濕肺/干肺的比例評(píng)估肺組織水腫的程度。

1.2.3肺臟HE染色(1)將取出的右肺切取一部分放入4%多聚甲醛中固定。(2)將固定過(guò)的標(biāo)本放入脫水機(jī)中脫水、透明、浸蠟。(3)經(jīng)以上處理后將標(biāo)本進(jìn)行包埋、切片、染色。(4)用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 MPO活性檢測(cè)(1)取肺組織100 mg加0.5%CTAB溶液1 ml; (2)用玻璃勻漿器制備勻漿，反復(fù)凍融(－80℃/37℃)三次; (3) 4℃條件下，3 000 r/min離心15 min; (4)取0.1 ml上清加反應(yīng)液2.9 ml; (5)保持溫度25°C，立即置分光光度計(jì)在460 mm波長(zhǎng)下進(jìn)行2 min時(shí)間掃描。以第30秒到第90秒的1 min內(nèi)吸光度的變化代表酶活力的改變。1單位MPO活力以25℃時(shí)分解1 mmol過(guò)氧化氫來(lái)表示。

1.2.5支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)(1)收集支氣管肺泡灌洗液，3 000 r/min，4℃離心10 min; (2)棄去上清，50 μl PBS重懸細(xì)胞; (3) Giemsa染色，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.2.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子濃度根據(jù)細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法，分別檢測(cè)各組小鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α 和IL-1β的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的數(shù)據(jù)用x ±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

圖1　安石榴甙對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALT肺臟組織病理變化的影響Fig．1 An punicalagin influence on LPS-induced ALI pathological changes in lung tissue

Note: A.Normal control group; B.LPS group; C.LPS +dexamethasone group; D－F.LPS+punicalagin group(10 mg/kg，20 mg/kg，40 mg/kg) .

2.1安石榴甙對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI肺臟組織病理變化的影響小鼠肺組織HE染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肺臟表現(xiàn)為正常的組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征，LPS組肺臟顯示大面積炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，肺泡上皮完整性破壞和肺實(shí)質(zhì)的損傷。然而，不同劑量的安石榴甙組LPS誘導(dǎo)的肺組織病理?yè)p失均明顯減輕，這和地塞米松具有同樣的治療效果(圖1)。

2.2安石榴甙抑制LPS誘導(dǎo)的濕肺/干肺重量比

通過(guò)稱量ALI小鼠經(jīng)過(guò)不同處理后的肺臟重量，計(jì)算肺的濕肺/干肺重量比觀察肺組織滲出、水腫的情況。結(jié)果表明，和正常對(duì)照組相比(濕肺的重量是干肺重量的約4倍)，LPS處理后，肺組織的滲出和水腫非常明顯，濕肺的重量是干肺重量的約8倍。而不同劑量的安石榴甙或者地塞米松預(yù)處理后顯著減低ALI小鼠中濕肺/干肺重量比(P＜0.05)。說(shuō)明安石榴甙可以減輕由于LPS刺激所導(dǎo)致肺組織滲出、水腫。

2.3安石榴甙減少肺組織灌洗液中的炎癥細(xì)胞注射LPS 7 h后，收集肺組織灌洗液中的細(xì)胞，計(jì)數(shù)灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的數(shù)量。如圖3所示，相對(duì)于正常對(duì)照組，注射LPS后可以顯著提高肺泡灌洗液中的總炎癥細(xì)胞數(shù)量，以及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。但是，不同劑量的安石榴甙和地塞米松可以顯著減少肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量(圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Note: * .P＜0.05.

圖3　安石榴甙減少肺組織灌洗液中的炎癥細(xì)胞Fig．3 An punicalagin can reduce inflammatory cells in lung tissue lavage fluid

Note: * .P＜0.05.

2.4安石榴甙減少促炎細(xì)胞因子的分泌LPS注射后7 h，ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的濃度。結(jié)果表明，LPS處理后，肺泡灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的濃度顯著升高。但是，安石榴甙可明顯降低肺泡灌洗液中的細(xì)胞因子濃度(P＜0.05)，而且這種作用具有劑量依賴性，隨著濃度的增加，安石榴甙對(duì)炎性細(xì)胞因子的抑制作用更加明顯(圖4)。

2.5安石榴甙抑制LPS導(dǎo)致的MPO活性增加

MPO的活性是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的可信標(biāo)志。如圖5所示，相對(duì)于正常對(duì)照組，LPS刺激后顯著增加了MPO的活性。而安石榴甙組和地塞米松組中LPS引起的MPO的活性增強(qiáng)被明顯抑制(P＜0.05)。說(shuō)明安石榴甙減少了LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞在肺組織中的浸潤(rùn)。

Note: * .P＜0.05.

3　討論

LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分，LPS進(jìn)入肺組織后，可激發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致急性肺損傷［10］。炎癥反應(yīng)引起的組織損傷是急性肺損傷的重要病理基礎(chǔ)，而局部炎癥的特征性標(biāo)志是細(xì)胞的大量聚集，眾多細(xì)胞因子在中性粒細(xì)胞聚集過(guò)程中起了重要作用［11］。MPO是中性粒細(xì)胞的一種酶，其水平和活性直接反映了中性粒細(xì)胞的功能和活化狀態(tài)［12］。急性肺損傷常伴隨有炎癥反應(yīng)及多種炎性細(xì)胞因子的釋放，引起中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和肺組織中MPO可間接

反映肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的滲出和積聚量［13，14］。本研究中安石榴甙的使用劑量主要根據(jù)Jean-Gilles等人的研究成果［15］。本研究結(jié)果表明，安石榴甙可以減輕LPS導(dǎo)致的肺組織的損傷，可以減輕肺組織的滲出和水腫;明顯減少了支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量;可顯著減低肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的濃度;減少了中性粒細(xì)胞在肺組織中的浸潤(rùn)。綜上所述，安石榴甙對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用，但是安石榴甙在急性肺損傷中的治療劑量和不良反應(yīng)，有待進(jìn)一步研究?？赏麑彩襁伴_(kāi)發(fā)成為一類新的急性肺損傷保護(hù)劑而應(yīng)用于臨床疾病的治療。

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［收稿2015-02-14修回2015-03-18］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．007

作者簡(jiǎn)介:李曉娟(1974年－)，女，檢驗(yàn)科主任，副主任檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)方面的研究。

文章編號(hào)1000-484X(2015) 10-1329-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號(hào)R392.9