王靜，梁慧玲，楊秀芳*， 涂云飛

（1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016）

茶皂素（Tea Saponin），又稱茶皂甙，是一類天然糖甙化合物，主要由配基（C30H50O6）、糖體和有機(jī)酸的基本結(jié)構(gòu)構(gòu)成的一種五環(huán)三萜類皂素。油茶餅粕中茶皂素含量較高，達(dá)10%～15%，是茶皂素的一個(gè)重要來(lái)源[1]。茶皂素具有較強(qiáng)的發(fā)泡、乳化、分散、濕潤(rùn)等作用，是一種性能優(yōu)良的非離子表面活性劑，可廣泛應(yīng)用于日化、醫(yī)藥、建材、農(nóng)藥以及其它一些領(lǐng)域，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高[2]。

茶皂素的早期提取是以水為溶劑 （稱水浸法），水浸法所得茶皂素純度低，顏色深，黏度大，純度不高，限制了茶皂素的應(yīng)用[3]。目前茶皂素的提取多采用醇提法[4]或有機(jī)溶劑提取法[5]。

紅茶菌是用糖茶水為原料，經(jīng)過(guò)乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等微生物共同發(fā)酵，而制成的酸甜味飲料。在紅茶菌中含有的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等微生物共同作用下，可將可溶性的多糖轉(zhuǎn)變成為菌膜，因此紅茶菌的發(fā)酵過(guò)程會(huì)使原料液中的糖類成分含量下降而轉(zhuǎn)變成為較易去除的菌膜。同時(shí)，根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，茶籽餅粕水溶液中接種紅茶菌發(fā)酵后，對(duì)茶皂素具有絮凝沉淀的作用。因此在茶籽餅粕中接種紅茶菌進(jìn)行發(fā)酵，有望開發(fā)成一種精制茶皂素的新方法。

本研究采用正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)方式、發(fā)酵時(shí)間、種子液量和發(fā)酵液濃度四個(gè)因素進(jìn)行分析，同時(shí)也對(duì)精制后的茶皂素進(jìn)行了薄層層析和品質(zhì)鑒定，最后結(jié)合獲得的最佳發(fā)酵條件，使用80%乙醇進(jìn)一步浸提，獲得純度較高、顏色較淺的茶皂素。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

茶籽餅粕：購(gòu)自新昌縣益生茶業(yè)科技有限公司，茶皂素含量約為25%；茶皂素粗品：純度約為50%，市售；紅茶菌：浙江省茶資源跨界應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保留菌種；濃硫酸，無(wú)水乙醇，甲醇，香草醛，乙酸乙酯，α-萘酚，醋酸鉛，醋酸酐和正丁醇：均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

AL-204型電子天平，梅特勒-托利儀器 （上海）有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；ZHWY-2012C型生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；LD-IIB型低速離心機(jī)，無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司。

1.3 正交設(shè)計(jì)

由于茶皂素具有一定的抑菌作用，因此濃度較高的茶皂素可能會(huì)抑制紅茶菌的生長(zhǎng)[6]。預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)10%的茶籽餅粕水提液（離心去除沉淀）接種紅茶菌后，發(fā)酵情況較好，因此正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了三個(gè)不同的茶籽餅粕水提液濃度，分別為8%、10%和12%，實(shí)驗(yàn)中所使用的培養(yǎng)基體積均為50 mL。本實(shí)驗(yàn)較之前的研究加大了紅茶菌的接種量，分別加入紅茶菌種子液10 mL、20 mL 和30 mL，因此猜測(cè)對(duì)茶皂素的絮凝沉淀會(huì)更快達(dá)到平衡，設(shè)立了24 h 和48 h 兩個(gè)發(fā)酵時(shí)間。紅茶菌為一類好氧菌，之前研究均使用靜置培養(yǎng)（利于形成菌膜），本研究中采用了兩種培養(yǎng)方式，搖床和靜置培養(yǎng)兩種方式。正交因素水平表如表1所示。

茶籽餅粕接種紅茶菌液后在28℃下培養(yǎng)。

在前期研究中，分別對(duì)發(fā)酵一段時(shí)間之后的上清液及沉淀中的茶皂素含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明95%以上的茶皂素存在于絮凝沉淀中。因此在本研究中，發(fā)酵結(jié)束后，去除菌膜，離心取沉淀，并測(cè)定沉淀的干重作為衡量指標(biāo)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonaldesign

1.4 茶皂素的測(cè)定方法

茶皂素的測(cè)定方法采用香草醛-硫酸法[7]。

1.5 組分比較

對(duì)所制得的茶皂素定性鑒定采用硅膠薄層層析技術(shù)，展呈體系為乙酸乙酯∶甲醇∶正丁醇∶水=3∶2∶5∶10 的上相，展呈完畢用5%的濃硫酸乙醇溶液噴霧顯色，對(duì)微生物精制所得茶皂素與市售茶皂素粗品進(jìn)行比較。

1.6 定性鑒定

Molish 反應(yīng)[8]：配制好一定濃度的油茶皂素溶液，取少許于比色管中，滴加少量10%α-萘酚乙醇溶液，將比色管適當(dāng)傾斜后小心注入濃硫酸，然后觀察液面的分層處是否出現(xiàn)紫紅色的現(xiàn)象。

Libermann Burchard 反應(yīng)[8]：取少許油茶皂素粗品，置于比色管中，加入5 mL 醋酐，再添加幾滴濃硫酸進(jìn)行反應(yīng)，觀察顏色的改變。

沉淀反應(yīng)[8]：取配制好的油茶皂素溶液少量加入醋酸鉛，振蕩后看是否有沉淀產(chǎn)生。

1.7 乙醇沉淀進(jìn)一步精制

使用正交實(shí)驗(yàn)所得的優(yōu)化發(fā)酵條件，進(jìn)行茶皂素的生物精制，所得的絮凝沉淀部分隨后使用乙醇進(jìn)行進(jìn)一步的精制。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，80%的乙醇對(duì)于茶皂素的精制效果最佳，因此后續(xù)研究使用80%的乙醇作為進(jìn)一步精制的提取劑。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2007 軟件分析，正交實(shí)驗(yàn)由Matlab 設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所得到茶皂素沉淀量分析結(jié)果如表2所示。四個(gè)因素對(duì)茶皂素沉淀量的影響因素大小排序?yàn)椋篋 發(fā)酵液濃度＞B 發(fā)酵時(shí)間＞C種子液量＞A 培養(yǎng)方式。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 The result and analysis of orthogonal experiments

表3 正交實(shí)驗(yàn)極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiments

根據(jù)之前的研究表明，溶液中95%的茶皂素會(huì)被紅茶菌絮凝沉淀，因此為了獲得較大量的茶皂素，茶皂素的沉淀較多為宜。由表3可以看出，A1（搖床培養(yǎng)）、B2（發(fā)酵 48 h）、C3（接種種子液量30 mL）和D3（發(fā)酵液濃度12%）條件下可以獲得的茶皂素沉淀含量最大。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程，由于搖床培養(yǎng)會(huì)造成紅茶菌菌膜難以形成，離心也難以去除，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)方式對(duì)于茶皂素沉淀的影響較小，因此靜置培養(yǎng)可能較為適合。

2.2 茶皂素組分分析

微生物精制茶皂素與市售茶皂素薄層層析結(jié)果如圖1所示，微生物精制的茶皂素成分組成與市售茶皂素粗品基本一致，表明紅茶菌發(fā)酵，對(duì)茶皂素的結(jié)構(gòu)并無(wú)影響。

圖1 微生物精制茶皂素與市售粗品硅膠薄層層析比較Fig.1 The comparison of thin layer chromatography between purification and crudetea saponin

2.3 茶皂素定性鑒定

茶皂素品質(zhì)鑒定結(jié)果如表4 和圖2所示，微生物精制的茶皂素和市售的茶皂素粗品品質(zhì)保持一致，表明微生物發(fā)酵不會(huì)改變茶皂素的品質(zhì)。

表4 品質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of characterization tests

圖2 精制茶皂素與市售茶皂素粗品的品質(zhì)鑒定比較Fig.2 The comparison of characterization tests between purification and crudetea saponin

2.4 乙醇進(jìn)一步精制結(jié)果

使用正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，所獲得的發(fā)酵液離心后獲得的茶皂素絮凝沉淀使用80%的乙醇進(jìn)行進(jìn)一步純化，所得茶皂素含量及純度如表5所示，精制后經(jīng)噴霧干燥后的成品如圖3所示。結(jié)果表明，經(jīng)微生物發(fā)酵后，進(jìn)一步采用80%的乙醇精制，可獲得85%左右純度的茶皂素。從圖3 中可以看出，精制后的茶皂素色澤較淺。

表5 經(jīng)80%乙醇進(jìn)一步純化后茶皂素得率和純度Table 5 The yield and purity of tea saponin with 80%ethanol purified

圖3 微生物精制茶皂素與市售粗品顏色比較Fig.3 The comparison of color between purification and crudetea saponin

3 討論

茶皂素是一種天然表面活性劑，在醫(yī)藥、日化、農(nóng)藥等領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用前景。紅茶菌作為一種復(fù)合益生菌，具有代謝多糖的功效；同時(shí)，由于微生物的發(fā)酵，使發(fā)酵液中的pH 值下降，而茶皂素在酸性條件下易沉淀，因此也產(chǎn)生了絮凝、沉淀茶皂素的特點(diǎn)。本研究將紅茶菌接種到茶皂素水溶液中，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了紅茶菌在茶皂素水溶液中的發(fā)酵工藝，并已申請(qǐng)發(fā)明專利[9]。結(jié)果表明，12%的茶籽餅粕水提液中接種30 mL種子液，靜置的方式培養(yǎng)48 h可以獲得較大量的茶皂素絮凝沉淀。

通過(guò)薄層層析及定性鑒定實(shí)驗(yàn)，將微生物發(fā)酵絮凝獲得的茶皂素與市售茶皂素進(jìn)行了比較，從結(jié)果可以看出，微生物發(fā)酵的過(guò)程并未對(duì)茶皂素的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)產(chǎn)生影響。

隨后進(jìn)一步采用乙醇浸提的方式精制茶皂素。通過(guò)正交所得的最佳發(fā)酵條件下絮凝的茶皂素沉淀粗品，在80%的乙醇提取后純度可達(dá)85%左右。

本研究通過(guò)微生物發(fā)酵結(jié)合乙醇浸提的方式，對(duì)茶籽餅粕中的茶皂素進(jìn)行了精制。在精制過(guò)程中避免使用有機(jī)試劑，且生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本較低，同時(shí)也提高了生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品的安全性，所得產(chǎn)品可在日化等領(lǐng)域廣泛使用。

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