謝霖　史燕洪　劉寶生　方繼朝

摘要：為明確實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)的3個(gè)灰飛虱地理種群（云南楚雄、江蘇南京、江蘇建湖）共生菌Wolbachia的感染情況以及Wolbachia對(duì)灰飛虱生殖的影響，首先利用PCR技術(shù)對(duì)這些種群的Wolbachia進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有種群均感染了Wolbachia，楚雄、南京、建湖種群的感染率分別為91.5%、66.1%、84.0%。接著用Wolbachia的wsp基因的特異性引物從3個(gè)地理種群中都擴(kuò)增出1段599 bp的基因片段，通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)這3個(gè)種群的Wolbachia具有完全相同的wsp基因序列，同屬于Con株系。最后，在嚴(yán)格的試驗(yàn)條件下對(duì)建湖種群的灰飛虱進(jìn)行了雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明：Wolbachia對(duì)灰飛虱生殖表現(xiàn)出高強(qiáng)度的單向胞質(zhì)不親和；Wolbachia可能對(duì)宿主生殖具有負(fù)面影響；另外，研究還發(fā)現(xiàn)親本雙方全部感染W(wǎng)olbachia時(shí)，其子代感染率僅為82.14%，Wolbachia的卵傳率未達(dá)到100%，這可能與Wolbachia在灰飛虱種內(nèi)的垂直傳播有關(guān)。

關(guān)鍵詞：灰飛虱；Wolbachia；感染率；生殖力；胞質(zhì)不親和；地理種群

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.112+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0145-04

沃爾巴克氏體（Wolbachia）是存在于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的一種立克次氏體共生菌，其分類(lèi)地位屬原核生物界、細(xì)菌門(mén)、變形菌綱的α亞綱、立克次氏體目、立克次氏體科、Wolbachia屬，在宿主中通過(guò)細(xì)胞質(zhì)遺傳給下一代。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前有15%～20%的昆蟲(chóng)感染了這類(lèi)細(xì)菌，是迄今為止已知的最廣泛存在的胞內(nèi)共生菌之一，遍及昆蟲(chóng)綱的十多個(gè)目，灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallèn）體內(nèi)也有這種立克次氏體細(xì)菌[1]。這類(lèi)細(xì)菌能夠?qū)λ拗鬟M(jìn)行生殖調(diào)控，引發(fā)宿主多種生殖異常行為，導(dǎo)致細(xì)胞胞質(zhì)不親和（cytoplasmic incompatibility，CI）[2]、雌性化（feminization）[3-4]和孤雌生殖（parthenogenesis inducing，PI）[5-6]等現(xiàn)象，其中研究最多的是細(xì)胞胞質(zhì)不親和現(xiàn)象。細(xì)胞胞質(zhì)不親和現(xiàn)象通常出現(xiàn)在2種交配情況，即感染了Wolbachia雄性個(gè)體與非感染的雌性個(gè)體交配（單向CI），或與感染了不同品系的Wolbachia的雌性個(gè)體交配（雙向CI），這2類(lèi)交配產(chǎn)生的后代在胚胎發(fā)育的早期就全部或大部分死亡，而其他組合方式的交配則產(chǎn)生正常數(shù)目的子代。通過(guò)對(duì)宿主生殖和適合度的調(diào)控，Wolbachia能夠穩(wěn)定地在種群間進(jìn)行水平和垂直傳播，這樣Wolbachia就能有效侵入宿主群體并在宿主群體內(nèi)擴(kuò)散，在Wolbachia擴(kuò)散的同時(shí)，還能帶動(dòng)與之相聯(lián)系的其他細(xì)胞質(zhì)因子在宿主群體間傳播。

灰飛虱屬同翅目（Homoptera）飛虱科（Delphacidae），是目前影響我國(guó)水稻穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要害蟲(chóng)之一。其廣泛分布于東亞、東南亞、歐洲和北非等地，幾乎遍及我國(guó)所有的稻區(qū)，包括華南、華中、華北、東北以及西南稻區(qū)，其中以長(zhǎng)江中下游和華北稻區(qū)發(fā)生較多[7]?；绎w虱最具毀滅性的危害方式是傳播水稻條紋葉枯病，該病自20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已在16個(gè)省、市、區(qū)均有發(fā)生，成為我國(guó)分布最廣、危害最嚴(yán)重的一種水稻病毒病，嚴(yán)重時(shí)可造成水稻大面積減產(chǎn)甚至絕收[8]。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Wolbachia能引起灰飛虱的生殖異?，F(xiàn)象[9]，為進(jìn)一步明確實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)的不同灰飛虱地理種群共生菌Wolbachia的感染情況，了解Wolbachia對(duì)灰飛虱的生殖調(diào)控作用，本試驗(yàn)利用PCR技術(shù)對(duì)不同地理種群灰飛虱體內(nèi)的Wolbachia進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)灰飛虱群體進(jìn)行遺傳雜交試驗(yàn)，為了解Wolbachia在宿主群體間的水平和垂直傳播規(guī)律以及近幾年發(fā)生的灰飛虱再猖獗現(xiàn)象提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及飼養(yǎng)方法

供試灰飛虱成蟲(chóng)分別于2001年5月采自云南省楚雄市、2009年5月采自江蘇省南京市、江蘇省建湖縣，隨后在人工氣候室內(nèi)用武育粳3號(hào)稻苗分別飼養(yǎng)至今，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃、相對(duì)濕度60%、光照周期16 h（日）/8 h（夜）。

1.2 灰飛虱總DNA的提取

在裝有單頭灰飛虱成蟲(chóng)的1.5 mL離心管內(nèi)加入200 μL研磨緩沖液（100 mmol/L NaCl，200 mmol/L蔗糖，pH值9.1的100 mmol/L Tris-HCl ，50 mmol/L EDTA，0.5% SDS，100 μg/mL蛋白酶K），研磨勻漿后再加入200 μL研磨緩沖液混勻，65 ℃溫育1 h，加入乙酸鉀（8 mol/L）至終濃度1 mol/L，冰上靜置30 min，12 000 r/min離心15 min，吸出上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，在-20 ℃放置過(guò)夜，充分沉淀DNA，次日于12 000 r/min離心15 min，干燥后溶解于 30 μL 超純水中。

1.3 PCR檢測(cè)灰飛虱體內(nèi)的共生菌Wolbachia

參考Zhou等根據(jù)Wolbachia wsp基因序列設(shè)計(jì)的1對(duì)特異性引物來(lái)檢測(cè)灰飛虱是否感染共生菌[10]，上游、下游引物分別是：5′-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3′、5′-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3′。25 μL PCR反應(yīng)體系組成為：15.3 μL ddH2O，2.5 μL 10×Buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL dNTPs（各2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，0.2 μL Taq DNA聚合酶（大連TaKaRa公司），上下游引物各0.5 μL（各10 μmol/L）。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。endprint

1.4 序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)定序列。每個(gè)地理種群隨機(jī)抽取5個(gè)已感染W(wǎng)olbachia的樣本進(jìn)行序列測(cè)定，以它們的一致序列為準(zhǔn)。

1.5 篩選100%感染和100%不感染W(wǎng)olbachia的灰飛虱品系

1.5.1 篩選100%感染W(wǎng)olbachia的灰飛虱品系 隨機(jī)挑選在建湖縣田間采集的自然種群灰飛虱雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)各1頭于一次性透明塑料杯中進(jìn)行配對(duì)產(chǎn)卵，配對(duì)20對(duì)左右，1周后將成蟲(chóng)挑出用PCR檢測(cè)Wolbachia的感染情況。待卵全部孵化成若蟲(chóng)后，保留雙親都感染W(wǎng)olbachia的后代繼續(xù)飼養(yǎng)。待F1代長(zhǎng)至成蟲(chóng)時(shí)重復(fù)上述步驟進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，從而獲得100%感染W(wǎng)olbachia的純系（用“W+”表示）。

1.5.2 篩選100%不感染W(wǎng)olbachia的灰飛虱品系 隨機(jī)挑選建湖縣田間采集的自然種群灰飛虱，于0.1%四環(huán)素藥水浸泡的稻苗上飼養(yǎng)，連續(xù)繼代飼養(yǎng)3代后用PCR技術(shù)對(duì)灰飛虱進(jìn)行Wolbachia檢測(cè)，結(jié)果表明均不感染W(wǎng)olbachia，從而獲得100%不感染W(wǎng)olbachia的純系（用“W-”表示）。

1.6 遺傳雜交試驗(yàn)

為檢驗(yàn)Wolbachia對(duì)灰飛虱生殖的影響，選用江蘇建湖種群篩選出的2種灰飛虱品系進(jìn)行遺傳雜交試驗(yàn)，4種雜交組合分別為：♀（W+）×♂（W+）、♀（W-）×♂（W-）、♀（W+）×♂（W-）、♀（W-）×♂（W+）。

試驗(yàn)具體方法為：在每根玻璃試管中套入1頭5齡灰飛虱若蟲(chóng)，然后扎好試管口待其羽化，以確保用于雜交的雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)都是未交配過(guò)的。將剛羽化的雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)各1頭配對(duì)于長(zhǎng)有水稻苗的一次性透明塑料杯中，讓其交配產(chǎn)卵5 d，每天更換產(chǎn)卵稻苗，5 d后移走雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)，每個(gè)雜交組合至少有5個(gè)重復(fù)，當(dāng)卵孵化為若蟲(chóng)后，記錄有效產(chǎn)卵量、卵孵化期、若蟲(chóng)的發(fā)育歷期、雌雄性比、后代感染率等結(jié)果，最后解剖用于產(chǎn)卵的稻苗，記錄產(chǎn)卵日期、未孵化卵量，從而得到不同組合灰飛虱的產(chǎn)卵前期、總產(chǎn)卵量和孵化率。

1.7 數(shù)據(jù)整理和分析

每組雜交試驗(yàn)均至少設(shè)置5個(gè)重復(fù)，所得數(shù)據(jù)均采用DPS軟件（7.05版）中的Tukey多重比較方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，每組數(shù)據(jù)取平均值進(jìn)行不同組合的差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wolbachia在灰飛虱種群中的感染情況及各種群wsp基因序列比較

對(duì)3個(gè)灰飛虱種群中Wolbachia的感染情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有種群均感染W(wǎng)olbachia（表1），楚雄、南京、建湖種群的感染率分別為91.5%、66.1%、84.0%，3個(gè)種群Wolbachia的感染率都較高。

用Wolbachia的wsp基因特異性引物從3個(gè)地理種群中都擴(kuò)增出1段599 bp的基因片段，測(cè)序后將各種群的基因片段序列上傳至NCBI并獲得GenBank登錄號(hào)，分別為JN104053（楚雄種群）、JN104054（建湖種群）、JN104055（南京種群）。使用GeneDoc對(duì)3個(gè)地理種群灰飛虱體內(nèi)Wolbachia的wsp基因序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)種群的Wolbachia具有完全相同的wsp基因序列，而且和Con品系Wolbachia的wsp基因序列（GenBank登錄號(hào)AF020080）完全相同（圖1）[10]，說(shuō)明這3個(gè)種群的灰飛虱感染的Wolbachia同屬于Con株系。

2.2 Wolbachia對(duì)灰飛虱生殖的影響

在江蘇建湖灰飛虱種群的雜交試驗(yàn)中，感染W(wǎng)olbachia的雄性灰飛虱與未感染W(wǎng)olbachia的雌性灰飛虱交配后，每天觀察產(chǎn)卵稻苗都未發(fā)現(xiàn)若蟲(chóng)孵出，將稻苗保濕培養(yǎng)2周后解剖，發(fā)現(xiàn)稻苗內(nèi)有未孵化的卵；而其他3個(gè)雜交組合配對(duì)后8～9 d 就會(huì)發(fā)現(xiàn)有若蟲(chóng)孵化，說(shuō)明它們均能正常交配并產(chǎn)生后代。

從表2可以看出，是否感染W(wǎng)olbachia對(duì)灰飛虱的產(chǎn)卵前期和卵孵化率沒(méi)有顯著影響，但對(duì)卵孵化期、有效產(chǎn)卵量、總產(chǎn)卵量有顯著影響。未感染W(wǎng)olbachia的雌蟲(chóng)所產(chǎn)的卵孵化期極顯著長(zhǎng)于感染W(wǎng)olbachia的雌蟲(chóng)所產(chǎn)的卵；未感染W(wǎng)olbachia的雄蟲(chóng)與未感染W(wǎng)olbachia的雌蟲(chóng)交配產(chǎn)生的卵量顯著多于與感染W(wǎng)olbachia的雌蟲(chóng)交配產(chǎn)生的卵量。

2.3 不同雜交組合后代若蟲(chóng)Wolbachia感染率的比較

對(duì)3個(gè)雜交組合的所有后代進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確定其后代若蟲(chóng)的Wolbachia感染率。為了保證PCR的準(zhǔn)確性，每頭灰飛虱若蟲(chóng)均經(jīng)過(guò)2～3次PCR檢測(cè)，每個(gè)批次PCR均有清水作為陰性對(duì)照，每次瓊脂糖凝膠電泳均有DNA marker作為分子量標(biāo)記。從表2看出，雌成蟲(chóng)、雄成蟲(chóng)均感染W(wǎng)olbachia的后代，后代感染率僅為82.14%；經(jīng)過(guò)四環(huán)素處理后的雌成蟲(chóng)、雄成蟲(chóng)后代，經(jīng)檢測(cè)均未感染W(wǎng)olbachia；感染雌蟲(chóng)和未感染雄蟲(chóng)交配所產(chǎn)生的后代，感染率為55.56%。

2.4 不同雜交組合后代若蟲(chóng)各齡期發(fā)育歷期的比較

由表3看出，3個(gè)雜交組合產(chǎn)生的后代，1、2、5齡若蟲(chóng)期均沒(méi)有顯著差異，但由于3、4齡若蟲(chóng)期有極顯著差異，因此整個(gè)若蟲(chóng)歷期表現(xiàn)出顯著差異；雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)全部感染和全部未感染W(wǎng)olbachia的組合產(chǎn)生的后代，其若蟲(chóng)發(fā)育歷期極顯著短于感染雌蟲(chóng)和未感染雄蟲(chóng)的組合（P<0.01）。

3 討論

本研究用Wolbachia的wsp基因特異性引物從3個(gè)灰飛虱地理種群中都擴(kuò)增出1段599 bp的基因片段。對(duì)楚雄、南京、建湖3個(gè)地理種群灰飛虱體內(nèi)Wolbachia的wsp基因序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，3個(gè)種群的Wolbachia具有完全相同的wsp基因序列，說(shuō)明這3個(gè)種群感染的Wolbachia同屬Con株系，并未表現(xiàn)地理隔絕現(xiàn)象；但在其他昆蟲(chóng)中，則報(bào)道過(guò)同種昆蟲(chóng)Wolbachia存在地理隔離的現(xiàn)象。Sun等對(duì)中國(guó)的橘小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）種群中的4個(gè)Wolbachia株系的wsp基因序列比對(duì)結(jié)果表明，它們分屬于Kue、Mel、Cuc 3個(gè)類(lèi)群[11]，這說(shuō)明中國(guó)的橘小實(shí)蠅種群中存在的Wolbachia有地理隔絕。在本研究中，灰飛虱體內(nèi)的Wolbachia同源性非常高，未表現(xiàn)地理隔離現(xiàn)象，分析其可能的原因有2個(gè)：（1）灰飛虱不同地理種群之間存在Wolbachia的橫向水平傳播；（2）灰飛虱不同地理種群間由于擴(kuò)散而存在種群的交流，Wolbachia也隨之而擴(kuò)散。endprint

Wolbachia作為節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的一種內(nèi)共生菌，研究得最多的就是它能引發(fā)宿主生殖異常行為，其中最普遍和常見(jiàn)的影響是誘導(dǎo)胞質(zhì)不親和（CI）。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)感染W(wǎng)olbachia的雄性灰飛虱與未感染W(wǎng)olbachia的雌性灰飛虱之間交配，所產(chǎn)的卵不能正常孵化，而感染W(wǎng)olbachia的雌性灰飛虱與未感染W(wǎng)olbachia的雄性灰飛虱之間進(jìn)行交配，能夠產(chǎn)生后代。這一現(xiàn)象證明了Wolbachia對(duì)灰飛虱生殖表現(xiàn)出高強(qiáng)度的單向胞質(zhì)不親和。崔建平等在室內(nèi)飼養(yǎng)的灰飛虱群體中也發(fā)現(xiàn)了這種胞質(zhì)不親和現(xiàn)象[12]。

近年來(lái)的資料表明，Wolbachia除了具有調(diào)控節(jié)肢動(dòng)物宿主生殖方式的作用外，對(duì)宿主的繁殖力、生長(zhǎng)發(fā)育速度、成活率、壽命等存在不同程度的影響。在本雜交試驗(yàn)中，Wolbachia對(duì)產(chǎn)卵前期和卵孵化率沒(méi)有顯著影響，但對(duì)卵孵化期、有效產(chǎn)卵量、總產(chǎn)卵量有顯著影響。未感染W(wǎng)olbachia的雄蟲(chóng)與未感染W(wǎng)olbachia的雌蟲(chóng)交配產(chǎn)生的卵顯著多于與感染W(wǎng)olbachia的雌蟲(chóng)交配產(chǎn)生的卵；未感染W(wǎng)olbachia的雄蟲(chóng)與未感染W(wǎng)olbachia的雌蟲(chóng)交配產(chǎn)生的后代發(fā)育歷期極顯著短于與感染W(wǎng)olbachia的雌蟲(chóng)交配產(chǎn)生的后代歷期。這些數(shù)據(jù)表明，未感染W(wǎng)olbachia的灰飛虱個(gè)體具有生殖優(yōu)勢(shì)，Wolbachia 可能對(duì)宿主生殖具有負(fù)面影響。Fleury等也曾發(fā)現(xiàn)，果蠅（Drosophila simulan）的寄生蜂Leptopilina heterotoma工蜂被Wolbachia感染后其生殖力降低8%[13]。因?yàn)?Wolbachia 廣泛存在于宿主生殖細(xì)胞中，有可能它的存在危害了生殖細(xì)胞[14]，最終導(dǎo)致了感染W(wǎng)olbachia的灰飛虱產(chǎn)卵量少于未感染的灰飛虱。

通過(guò)對(duì)3個(gè)雜交組合的后代若蟲(chóng)Wolbachia的感染率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)值得關(guān)注的現(xiàn)象：感染了Wolbachia的雌成蟲(chóng)、雄成蟲(chóng)的后代只有82.14%的感染率，并不是100%感染W(wǎng)olbachia，也就是說(shuō)Wolbachia的卵傳率未達(dá)到100%，這一結(jié)論與史文琦等的結(jié)論[15-16]一致，而與崔建平等提出的灰飛虱室內(nèi)種群的Wolbachia經(jīng)卵傳播率為100%的結(jié)論[12]相矛盾。推測(cè)可能的原因有3點(diǎn)：（1）與所使用的灰飛虱種群差異有關(guān)，本試驗(yàn)采用的是江蘇建湖灰飛虱種群，而崔建平等采用的是云南灰飛虱種群；（2）可能是崔建平等用于檢測(cè)Wolbachia感染率的樣本數(shù)量不夠多，導(dǎo)致未檢測(cè)到Wolbachia；（3）與Wolbachia在宿主體內(nèi)的分布部位有關(guān)，Wolbachia除了分布于灰飛虱的生殖組織外，還廣泛分布于頭、胸部肌肉、中腸、唾液腺、消化道等非生殖組織中[1]。因此筆者推測(cè)，分布于親本生殖組織的Wolbachia能100%垂直傳播給子代，而非生殖組織中的Wolbachia不能100%垂直傳播給子代，這就導(dǎo)致本試驗(yàn)中子代灰飛虱Wolbachia的感染率低于100%。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)不親和現(xiàn)象已經(jīng)被研究得很普遍，它的群體生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究也有了相當(dāng)?shù)姆e累[17]，且一些影響CI表達(dá)的因素也得到了證實(shí)，但是其生化機(jī)理與科學(xué)應(yīng)用價(jià)值尤其是生物防治方面的應(yīng)用前景還需要進(jìn)一步探究；另外，“Wolbachia的卵傳率未達(dá)到100%可能與Wolbachia在灰飛虱種內(nèi)的垂直傳播有關(guān)”假說(shuō)和“Wolbachia可能危害宿主生殖細(xì)胞”假說(shuō)也需要進(jìn)一步驗(yàn)證，如先用熒光共焦顯微鏡對(duì)宿主體內(nèi)的Wolbachia進(jìn)行定位，確定是在生殖細(xì)胞中還是非生殖細(xì)胞中，再根據(jù)共生位置設(shè)計(jì)雜交試驗(yàn)，以確定Wolbachia在灰飛虱種內(nèi)的垂直傳播規(guī)律。這些問(wèn)題的解決將會(huì)給Wolbachia在害蟲(chóng)綜合治理中提供更為廣闊的前景。

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