李娟　曹芳芳　權(quán)哲　劉海峰

摘要：采用RT-PCR與RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，從山葡萄果皮中克隆到黃烷酮3-羥化酶（F3H）基因的cDNA全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)1 398 bp，包含1 092 bp的完整開放閱讀框，編碼363個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為40.81 ku，等電點(diǎn)（PI）值為5.37。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，隨機(jī)卷曲是VamF3H蛋白最大量的結(jié)構(gòu)元件，不具有信號(hào)肽，屬于不穩(wěn)定親水蛋白。氨基酸序列與歐亞種葡萄（FQ389950）、圓葉葡萄（KF040970）、美國(guó)蔓藤（JX087441）等的F3H類基因同源性較高，相似性分別為99%、99%、96%。

關(guān)鍵詞：山葡萄；cDNA克??；黃烷酮3-羥化酶

中圖分類號(hào)： S663.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0036-05

黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）是花色素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因，是花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[1]。F3H屬于依賴2-酮戊二酸的雙加氧酶，反應(yīng)需要2-酮戊二酸、分子氧、鐵、抗壞血酸[2]。其作用為催化柚皮素C3位羥基化，生成二氫山奈酚（dihydrokaempferol，DHK），而DHK是黃酮和異黃酮合成的重要中間產(chǎn)物；因此，F(xiàn)3H調(diào)控著黃酮與花青素苷產(chǎn)物的合成，是整個(gè)黃酮類化合物代謝途徑的中樞位點(diǎn)[3]。有報(bào)道指出F3H與花青苷合成關(guān)系密切[4]，然而此方面的研究尚較少。Holton等發(fā)現(xiàn)F3H對(duì)黃烷酮、兒茶酸、原花青素、花青素代謝影響較大，是該代謝途徑的關(guān)鍵酶[3]。Lepiniec等研究證實(shí)，由F3H和F3′H催化生成的黃烷酮醇在DFR的催化作用下能夠合成無(wú)色花青素[5]。F3H的活性最初在紫羅蘭花中被檢測(cè)到[6]。Martin等利用鑒別篩選與基因圖譜技術(shù)首次從金魚草中分離克隆到F3H基因[7]。研究表明，F(xiàn)3H基因在矮牽牛等植物中是獨(dú)立表達(dá)的，而大多數(shù)情況下，F(xiàn)3H與其上游的CHS、CHI基因，以及下游的DFR基因協(xié)同表達(dá)[8]。在大多數(shù)物種中，F(xiàn)3H基因僅以單拷貝形式存在[9-11]。

山葡萄別稱野葡萄，最初發(fā)現(xiàn)于我國(guó)東北和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，在我國(guó)主要分布于吉林省長(zhǎng)白山、黑龍江省完達(dá)山、小興安嶺、遼寧省北部等地[12]。山葡萄是我國(guó)重要的野生果樹資源，具有極強(qiáng)的抗寒性，是東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料[13]，其漿果含有大量花色苷。目前，分子生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于葡萄遺傳育種的各個(gè)領(lǐng)域，加速了葡萄遺傳學(xué)圖譜、基因的克隆表達(dá)、新基因的分離鑒定等研究的進(jìn)展[14]。F3H基因已在玉米、矮牽牛花、水母雪蓮等很多植物中克隆得到并且定性[15]。在擬南芥、茄子、苜蓿、葡萄、蘋果、柑橘、梨、康乃馨、翠菊、日本牽牛等植物中均克隆到了F3H基因，但未見山葡萄中F3H基因的相關(guān)報(bào)道。本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)相結(jié)合的方法克隆F3H基因，獲得全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為闡明山葡萄花色苷的生物合成及調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試山葡萄品種為雙豐（Vitis amurensis Shuang Feng），采自國(guó)家山葡萄種質(zhì)資源圃。采摘無(wú)病蟲害、飽滿的成熟期果粒，立即置于液氮中冷凍，并于-80 ℃冰箱保存，取其果皮作為供試材料。

1.1.2 菌株、酶、生化試劑 Tris-HCl、CTAB、EDTA、無(wú)水LiCl、β-巰基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal均為AITiresco分裝試劑；大腸桿菌DH5α、pMD19-T載體、Taq酶、Marker DL 2 000均購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)錄酶SuPerscriptll購(gòu)自invitrogen公司；SMARTTM RACE試劑盒購(gòu)自Clonteeh公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物由英俊生物技術(shù)有限公司合成，DNA測(cè)序由上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 登錄NCBI網(wǎng)站，根據(jù)GenBank中已登陸的F3H基因的核苷酸序列和氨基酸序列，通過(guò)多序列比對(duì)確定其共有的保守區(qū)，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物用來(lái)擴(kuò)增目的片段。上游引物F1：5′-TGTCTGGTGGCAAGAAAGGC-3′；下游引物F2：5′-CGAGGGTGAGGTCTGGCTGT-3′。

以該引物擴(kuò)增出的序列設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE引物，分別為：F3H-a：5′-AGCGTCCTTGTCCAAATCCA-3′；F3H-s：5′-CGTTTCCAGCCATCTTCA-3′。

1.2.2 山葡萄果皮總RNA的提取及cDNA的合成 采用改良的CTAB[16]法提取山葡萄果皮中的總RNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其230、260、280 nm處的吸光度及總RNA濃度，用1%TAE檢測(cè)RNA的完整性。

按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書，以O(shè)ligo（dT）20為引物、總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA的第1條鏈。

1.2.3 PCR擴(kuò)增目的基因片段 以山葡萄cDNA第1鏈為模板，用引物F1、F2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系包括：2.0 μL cDNA、5.0 μL 10×Ex Taq Buffer（Me2+ free）、0.4 μL Ex Taq（5 U/μL）、36.6 μL ddH2O、F1和F2引物各1.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化目的片段。

1.2.4 5′RACE和3′RACE法獲得基因片段 參照SMARTTM RACE試劑盒說(shuō)明書，以逆轉(zhuǎn)錄分別合成的5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA為模板，以F3H-a、F3H-s分別同UPM為引物，進(jìn)行5′RACE、3′RACE擴(kuò)增以獲得5′端片段、3′端片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以確定條帶。

1.2.5 目的片段的回收和連接 按照膠回收試劑盒說(shuō)明書對(duì)PCR產(chǎn)物的DNA片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化。將回收的DNA片段與pMD-18載體連接，于16 ℃連接3 h。反應(yīng)體系為pMD-18載體0.5 μL、DNA片段4.5 μL、SolutionⅠ5.0 μL。

1.2.6 轉(zhuǎn)化 將DH5α感受態(tài)細(xì)胞解凍后，取50 μL加入10 μL連接產(chǎn)物，冰浴30 min；取出后熱激90 s，并置于冰上2～3 min；加入預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基300 μL，于37 ℃、190 r/min培養(yǎng)1 h；取適量菌液涂布于含有AMP、X-Gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑白色單克隆置于37 ℃搖床中，200 r/min培養(yǎng)12 h。隨后進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，將成功克隆的菌樣測(cè)序。

1.3 VamF3H基因序列及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

利用DNAstar軟件查找VamF3H基因的開放閱讀框（ORF）并推導(dǎo)其氨基酸序列；利用NCBI的BLAST程序檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)VamF3H基因全長(zhǎng)cDNA序列及其氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析；利用ProtParam在線軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析VamF3H基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；運(yùn)用ProtScale在線軟件（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）、TMHMM在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）、SignalP在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對(duì)所編碼蛋白質(zhì)的親水性、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽進(jìn)行分析；通過(guò)ExPASY中的HNN工具分析其蛋白質(zhì)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用GeneDoc軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄VamF3H基因cDNA全長(zhǎng)的克隆及序列分析

以山葡萄果皮總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用特異引物F1和F2擴(kuò)增出1條324 bp的預(yù)期片段（圖1-a）。經(jīng)Blastn分析發(fā)現(xiàn)，該序列與其他物種F3H基因高度同源，與歐亞種葡萄（FQ389950）的同源性高達(dá)99%，初步確認(rèn)其為山葡萄F3H基因的核心序列。根據(jù)所得中間段序列設(shè)計(jì)末端擴(kuò)增的特異引物F3H-a和F3H-s，經(jīng)RACE擴(kuò)增、產(chǎn)物克隆、測(cè)序后，分別得到長(zhǎng)度為965 bp的3′末端和647 bp的5′末端（圖1-b）。將RT-PCR和RACE擴(kuò)增片段進(jìn)行序列拼接得到VamF3H基因cDNA全長(zhǎng)序列，最終獲得1條長(zhǎng)為1 398 bp的cDNA全長(zhǎng)序列，經(jīng)Blastn比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該cDNA序列與其他物種的F3H基因同源。

經(jīng)DNAstar軟件分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA包含1個(gè)1 092 bp的完整開放閱讀框、214 bp的3′-非翻譯區(qū)、92 bp的5′-非翻譯區(qū)，推測(cè)其編碼363個(gè)氨基酸。GenBank登錄號(hào)為KP966099，將其命名為VamF3H。

2.2 VamF3H基因編碼蛋白質(zhì)的理化性狀

利用ProParam軟件在線預(yù)測(cè)分析VamF3H基因編碼蛋

白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由363個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量（MV）為40.81 ku，等電點(diǎn)值為5.37。組成VamF3H蛋白的20種氨基酸中亮氨酸（Leu）含量最高，達(dá)到9.9%；半胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp）含量最少，僅為1.4%。正電荷殘基（Arg+Lys）數(shù)為45個(gè)，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)為55個(gè)，不穩(wěn)定指數(shù)為44.25，脂肪指數(shù)為84.33，表明VamF3H基因蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 VamF3H蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)

利用NCBI的BlastP程序，在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)山葡萄VamF3H基因的蛋白保守區(qū)。結(jié)果表明，VamF3H具有2-酮戊二酸的雙加氧酶（2-ODD）結(jié)構(gòu)域、非血紅素雙加氧酶結(jié)構(gòu)域。VamF3H具有特征性結(jié)構(gòu)域FE2OG_OXY PS51471（圖2），屬于雙加氧酶家族。

2.4 VamF3H蛋白的親水性

利用ProtScale程序分析山葡萄VamF3H基因氨基酸序列的親水性及疏水性（圖3）。圖中縱坐標(biāo)為氨基酸標(biāo)度值，橫坐標(biāo)為氨基酸序列位置。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)、分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，可明顯看出疏水性最大值在第168位點(diǎn)，值為1.900；最小值在第145位點(diǎn)，值為-2.722?？偲骄H水性指數(shù)為-0.444，整體表現(xiàn)為親水性。

2.5 VamF3H蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域

根據(jù)TMHMM、TMpred Server網(wǎng)站分析，超過(guò)500分才被認(rèn)為顯著。可見VamF3H蛋白無(wú)跨膜螺旋，故可推測(cè)VamF3H不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.6 VamF3H蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)及二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用SignalP 4.1 Server軟件對(duì)山葡萄VamF3H基因蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，VamF3H基因編碼的蛋白不具有信號(hào)肽。

利用HNN軟件在線預(yù)測(cè)VamF3H基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由48.48%的無(wú)規(guī)卷曲（random coil）、32.78%的α-螺旋（alpha helix）、18.73%的β-折疊（extended strand）組成。

2.7 山葡萄VamF3H編碼蛋白質(zhì)的同源性及進(jìn)化

登陸NCBI主頁(yè)，利用BlastP在線軟件將克隆得到的VamF3H基因編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索比較。結(jié)果表明，該基因與歐亞種葡萄（FQ389950）、圓葉葡萄（KF040970）、美洲種葡萄（JX087441）、桑樹（KF438044）等的F3H類基因同源性較高，相似性分別為99%、99%、96%、81%。利用GeneDoc軟件對(duì)包括VamF3H在內(nèi)10個(gè)物種的F3H基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析（圖5），圖中劃線部分為保守結(jié)構(gòu)域。

為進(jìn)一步分析VamF3H與其他植物F3H之間的進(jìn)化關(guān)系，在多重比對(duì)的基礎(chǔ)上，利用Mega 6.0軟件對(duì)該基因及其他植物F3H基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖6）。結(jié)果表明，山葡萄VamF3H基因與歐亞種葡萄、圓葉葡萄、美國(guó)蔓藤的同源性最高，與梨、風(fēng)毛菊等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

本研究利用同源克隆和RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，從山葡萄果皮中克隆獲得F3H的同源基因VamF3H，并對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)卷曲為主，其次為α-螺旋，再次為β-折疊，無(wú)其他二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，此預(yù)測(cè)結(jié)果與已報(bào)道的草莓、葡萄、海棠F3H蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)一致[17]。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的蛋白具有典型2-O-酮戊二酸和Fe2+-依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeⅡ_Oxy）的保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中含有與鐵離子結(jié)合所需的組氨酸、天冬氨酸，以及與2-O-酮戊二酸結(jié)合所需的精氨酸、絲氨酸保守位點(diǎn)，這些都是植物雙加氧酶超家族基因的典型特征。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，VamF3H與同屬的歐亞種葡萄F3H親緣關(guān)系最近，而與薔薇科的梨、菊科的風(fēng)毛菊親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可見VamF3H的進(jìn)化具有明顯的種屬特性。

從以上核苷酸、氨基酸較高的相似系數(shù)可知，F(xiàn)3H基因在進(jìn)化上較為保守，因?yàn)镕3H僅以單拷貝形式存在于大多數(shù)物種中，提示F3H基因可能在花青素生成中具有重要地位。單拷貝基因比多拷貝基因更易于調(diào)控，且F3H基因在進(jìn)化上保守性很高，少數(shù)幾個(gè)堿基的突變就可能造成基因失活，從而阻礙花青素的生成。目前，關(guān)于控制花青素生成的研究主要集中于控制花青素生成的結(jié)構(gòu)酶，并通過(guò)轉(zhuǎn)入結(jié)構(gòu)酶的基因以獲得結(jié)構(gòu)酶的過(guò)量表達(dá)，從而增加花青素的生成，而關(guān)于調(diào)控結(jié)構(gòu)酶的基因或調(diào)控因子的研究尚未見報(bào)道；因此，研究花色素調(diào)控基因比單純研究結(jié)構(gòu)酶更具有意義。

通過(guò)獲得的F3H基因cDNA全長(zhǎng)序列，可在以下方面做進(jìn)一步研究。驗(yàn)證F3H基因在山葡萄中是否為單拷貝存在。F3H基因在很多物種中均以單拷貝存在，而葡萄中的F3H則為2個(gè)拷貝[18-20]，因此推測(cè)VamF3H也同為2個(gè)拷貝?？墒褂肧outhem Blot技術(shù)驗(yàn)證F3H基因在山葡萄的果皮、果肉、根、莖、葉、種子等部位中是否為2個(gè)拷貝。將已有的F3H基因作為探針，與山葡萄基因組文庫(kù)雜交，可獲得F3H基因組DNA序列，以進(jìn)行內(nèi)含子組成、外顯子組成、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等分子生物學(xué)分析，為山葡萄花色素的研究提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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