黃海楠黃海鷗 楊金生程榮華劉云志 任 銳姚新華*

1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，長春 130062；2.吉林省長春市動(dòng)物檢疫站，長春 130062

表達(dá)TGEVS基因AD片段的重組乳酸桿菌的構(gòu)建及免疫研究

黃海楠1黃海鷗2楊金生1程榮華1劉云志1任 銳1姚新華1*

1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，長春 130062；2.吉林省長春市動(dòng)物檢疫站，長春 130062

為構(gòu)建表達(dá)基因AD片段的重組乳酸桿菌，根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）S蛋白的抗原決定簇AD片段的基因序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增該片段，測序正確后利用穿梭質(zhì)粒整合進(jìn)益生乳酸菌中表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)過酶切、PCR和PAGE電泳鑒定重組的基因在乳酸菌中得到了表達(dá)。所以，獲得了表達(dá)基因AD片段的重組乳酸桿菌。

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）；抗原片段；乳酸菌

豬感染了傳染性胃腸炎病毒（TGEV）后引起的嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水并且高度接觸性傳染的傳染病就是豬傳染性胃腸炎。1946年 DOYLE和HUTCHINGS在美國首次報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)了該病。日本和英國先后在1956年和1957年報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)了該病，現(xiàn)在豬傳染性胃腸炎已經(jīng)成為一種世界性的豬疫病[1-3]。我國從60年代起就曾報(bào)導(dǎo)有豬傳染性胃腸炎的發(fā)生，近些年來該病更有進(jìn)一步擴(kuò)大流行的趨勢。該病常在冬季和早春等寒冷季節(jié)的某些區(qū)域呈地方性暴發(fā)流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的危害[4]。

豬傳染性胃腸炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白有4種。其中纖突糖蛋白（S）是主要的免疫蛋白，是惟一能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，給宿主提供免疫保護(hù)的結(jié)構(gòu)蛋白，它攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，并在決定宿主細(xì)胞的親嗜性、細(xì)胞融合、致病性和血凝作用等方面起重要作用[5]。TGEV的纖突糖蛋白有4個(gè)抗原位點(diǎn)分別是A、B、C、D，不同毒株之間A和D抗原位點(diǎn)高度保守，在誘導(dǎo)中和抗體過程中起主要作用。A或D抗原位點(diǎn)的缺失可導(dǎo)致纖突糖蛋白喪失產(chǎn)生中和抗體的能力。

由于AD位點(diǎn)對于TGEV產(chǎn)生中和抗體的重要性，因此我們利用分離到的毒株研制以乳酸桿菌為載體表達(dá)基因AD抗原片段的基因工程口服疫苗。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）毒株、細(xì)胞和菌株。病毒TGEV為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存在-80℃。豬腎傳代細(xì)胞IBRS2購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心。凍干的乳酸菌由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存在-80℃（付殿國研究員贈(zèng)予）。JM109感受態(tài)細(xì)胞購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司。

2）試劑。犢牛血清、胰酶、MEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、DEPC水均購自北京鼎國生物公司。Trizol試劑購自GIBCO公司。Ex TaqDNA聚合酶、dNTP（2.5 mmoL/L與10 mmoL/L）、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶、pMD18T載體、DL 2000和DL 15000 Marker為TakaRa寶生物工程（大連）公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒；DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）均購自TIANGEN BIOTECH公司。瓊脂糖、溴化乙錠（EB）均購自AMRESCO公司。

在大腸桿菌與乳酸菌中都能表達(dá)的穿梭載體pMG36e是由本實(shí)驗(yàn)室保存。紅霉素為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

3）儀器。SANYO MC0165型CO2培養(yǎng)箱；k5062184電轉(zhuǎn)化儀；HYBAID HBSP05220型PCR儀；DYY-8B型穩(wěn)壓流電泳儀；KZL-1型可見紫外檢測儀；EPPENDORF MINISPIN個(gè)人微型高速離心機(jī)；HH-2型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 含有TGEV的S蛋白的抗原片段的重組質(zhì)粒的制備

根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）S蛋白的抗原決定簇AD片段的基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對PCR引物S1、S2，前后分別添加了I和I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。PCR用引物均是PAGE級，由TaKaRa寶生物工程（大連）公司合成。

1）質(zhì)粒pMD18T-S-AD的制備。

①提取RNA：將豬傳染性胃腸炎病毒以1MOI的劑量接種長滿單層的IBRS2細(xì)胞，待90%的細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收集病變的細(xì)胞。用GIBCO公司的Trizol試劑按試劑使用說明操作提取總RNA。所有離心管和槍頭都用DEPC水處理過，保證確實(shí)沒有RNA酶。

②反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增片段全長共733 bp，位置位于S蛋白的1 102～1 812 bp，反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 90 s，65℃ 45 s，72℃45 s，共進(jìn)行30個(gè)反應(yīng)循環(huán)，72℃延伸 10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后電泳（1%瓊脂糖凝膠）。電泳大小正確的PCR產(chǎn)物，按DNA回收試劑盒說明書操作回收PCR產(chǎn)物。

③連接和轉(zhuǎn)化：將回收的PCR產(chǎn)物連接到T載體將連接產(chǎn)物10 μL加入至100 μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30 min。42℃水浴90 s后，再在冰中放置5 min。加入700 μL無抗性LB培養(yǎng)基，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng) 60 min。3 000 r/min離心5 min，留100 μL上清混勻后涂布于LB瓊脂平板上（紅霉素抗性100 μg/mL），37℃培養(yǎng)過夜。

④質(zhì)粒的獲得：小量提取重組質(zhì)粒DNA，電泳鑒定，剩余置-20℃保存。

a.酶切鑒定：分別用雙酶切和單酶切鑒定質(zhì)粒（雙酶切37℃ 4 h、單酶切37℃ 2 h）

反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定，對鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。

b.PCR鑒定：在合成的S-AD片段兩端設(shè)計(jì)鑒定引物，以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，合成片段長度約710 bp，反應(yīng)體系如下：

J1：5'ACTCTTGAAATTTCATGTTATAC 3'

J2：5'TTTTATAACAGCTGTGGCATCTA 3'

反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 90 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，共設(shè)30個(gè)反應(yīng)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后電泳。

⑤測序：將鑒定正確的質(zhì)粒在Takara公司測序。

2）重組質(zhì)粒pMG36e-S-AD的制備。

①酶切。37℃雙酶切4 h后電泳，按DNA回收試劑盒說明書操作回收目的基因片段S-AD片段和載體pMG36e。

②連接與轉(zhuǎn)化。

將純化回收的S-AD和pMG36e進(jìn)行連接，冰上操作，16℃過夜。反應(yīng)體系如下：

③重組質(zhì)粒的鑒定。

a.重組質(zhì)粒DNA的小量提取

b.酶切鑒定：（雙酶切37℃ 4 h、單酶切37℃2 h）

反應(yīng)結(jié)束后電泳，對酶切鑒定陽性的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。

c.PCR鑒定：以酶切鑒定陽性的質(zhì)粒為模板，以J1、J2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，合成片段長度約710 bp，反應(yīng)體系與條件同上。

d.重組質(zhì)粒pMG36e-S-AD DNA純化

（1）將3 mL粗制重組質(zhì)粒移至30 mL潔凈的離心管中，冰浴后加預(yù)冷的5 mol/L的LiCl 3 mL，顛倒混勻，12 000 r/min 4℃離心10 min。吸取上清至新的30 mL離心管中，加等體積的異丙醇，顛倒混勻，12 000 r/min室溫離心10 min。

（2）小心除去上清，倒置，用70%乙醇清洗管壁和沉淀，小心除去乙醇，保持沉淀的濕潤，用500 μL TE（pH8.0，含RnaseA）溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，室溫靜置30 min。

（3）酚氯仿和氯仿各抽提1次，1 mL滅菌水溶解沉淀，加500 μL PEG-MgCl2溶液，室溫靜置10 min后最大速度室溫離心20 min。

（4）用500 μL 70%乙醇重懸沉淀，最大速離心5 min，吸去上清，重復(fù)洗滌1次后，靜置10～20 min，用0.5 mL TE（pH8.0）溶解沉淀，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 乳酸菌的制備

1）復(fù)蘇培養(yǎng)。將凍干的乳酸菌用MRS培養(yǎng)基溶解后，在MRS瓊脂平板上劃線，37℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落接種4 mL MRS培養(yǎng)基37℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h復(fù)蘇。

2）乳酸菌感受態(tài)的制備。

①將過夜復(fù)蘇的乳酸菌按2%的比例接種20 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)4 h，當(dāng)細(xì)胞生長到OD600值為0.5～0.8時(shí)，8 000 r/min 0℃ 離心10 min收集沉淀。

3）重組質(zhì)粒pMG36e-S-AD的乳酸菌電穿孔轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

①取一管新制備的乳酸菌感受態(tài)冰浴5 min，加入重組質(zhì)粒5～10 μL，混勻，冰浴5 min。將混合物用預(yù)冷的槍頭移至預(yù)冷的內(nèi)徑0.2 cm的電穿孔杯中，設(shè)置電擊參數(shù)，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。

②將電擊混合物移入一預(yù)冷的1.5 mL離心管中，冰浴5 min后加入0.5 mL MRS培養(yǎng)基，37℃靜置3～4 h。

③取50 μL培養(yǎng)物涂布含紅霉素的MRS固體培養(yǎng)皿，37℃靜置培養(yǎng)48 h。

4）乳酸菌重組質(zhì)粒的鑒定。

①乳酸菌重組質(zhì)粒的提取。

a.取10mL過液培養(yǎng)的乳酸菌4℃ 8 000 r/min離心 10 min，用0.1 mol/L Tris溶液（pH7.5）洗滌沉淀，加入200 μL 25%蔗糖溶菌液（含30 mg/mL溶菌酶），37℃水浴15 min。

b.加入3%的SDS和0.2 mol/L的NaOH的混合液0.4 mL，立即混勻在室溫下靜置7 min，加入預(yù)冷的醋酸鈉（pH4.8）300 μL，立即顛倒混勻，4℃5 000 r/min離心15 min。棄上清，用320 μL的去離子水溶解沉淀，加入7.5 mol/L的醋酸銨（含0.5 mg/mL的EB）200 μL和酚氯仿350 μL，立即混勻，4℃ 8 000 r/min離心5 min。

孩子早期發(fā)熱并不是因?yàn)橹委煵患皶r(shí)轉(zhuǎn)為肺炎的，發(fā)病初期就是肺炎，發(fā)熱只是肺炎早期的一種表現(xiàn)。但是支原體肺炎早期癥狀和體征并不典型，即使發(fā)病初期到醫(yī)院診治，醫(yī)生通過聽診、血生化檢查、X光片也不會早期發(fā)現(xiàn)，因此支原體肺炎又叫“原發(fā)性非典型肺炎”（此非典型肺炎不是非典時(shí)期SARS病毒引起的肺炎）。

c.將上清移至1.5 mL離心管中，加入冰無水乙醇1 mL，混勻，室溫靜置30 min，4℃ 8 000 r/min離心15 min。移去上清，用70%乙醇洗沉淀，并溶于40 μL（含RNase 0.1 mg/mL）的水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

③PCR鑒定：用J1和J2鑒別引物鑒定。

④SDS-PAGE鑒定。

a.將鑒定為陽性的重組菌接入5 mL MRS液體培養(yǎng)基（含紅霉素）中，37℃靜置過夜。取2 mL接入100 mL含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基（添加40 mmol/L DL-蘇氨酸）中，37℃靜置培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。每隔1 h取1次菌液，取至7 h。同時(shí)同法誘導(dǎo)含空載體pMG36e的乳酸菌作對照。

b.將7次收獲的誘導(dǎo)菌液的OD600均調(diào)至0.6～0.8，取1.4 mL菌液，12 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀中加入1×SDS上樣緩沖液50 μL（含1/10的DTT），沸水煮10 min，25℃ 12 000 r/min離心10 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

2 結(jié) 果

電泳結(jié)果見圖1和圖2。圖1所示S-AD雙酶切片段為710 bp，圖2所示pMG36e雙酶切片段為3 600 bp。

圖1 I和I雙酶切質(zhì)粒P1

圖2 I和I雙酶切載體質(zhì)粒pMG36e

2.2 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMG36e-S-AD

圖3 I和I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMG36e-P1

2.3 PCR鑒定pMG36e-S-AD

以鑒定引物J1、J2擴(kuò)增雙酶切陽性的質(zhì)粒，都能擴(kuò)增到約710 bp左右大小的片段，如圖4。

圖4 PCR鑒定重組質(zhì)粒pMG36e-P1

2.4 雙酶切鑒定乳酸菌中的重組質(zhì)粒pMG36e-S-AD

圖5 雙酶切鑒定乳酸菌中重組質(zhì)粒pMG36e-P1

2.5 PCR鑒定乳酸菌中的重組質(zhì)粒pMG36e-S-AD（圖6）

圖6 PCR鑒定乳酸菌中的重組質(zhì)粒pMG36e-P1

2.6 SDS-PAGE結(jié)果

取誘導(dǎo)了7 h的含有重組質(zhì)粒的乳酸菌及誘導(dǎo)的含空載體pMG36e的乳酸菌菌液為空白對照進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)分析，從圖7可見重組基因得到了表達(dá)，蛋白質(zhì)的相對分子量約為34 ku，與預(yù)期一致，而空載體則未見表達(dá)。

圖7 SDS-PAGE電泳檢測重組的rS-AD基因表達(dá)產(chǎn)物

3 討 論

3.1 表達(dá)的靶基因的選擇

疫苗具有較好免疫效果的關(guān)鍵是選擇正確的重組表達(dá)的靶基因，原則上是選擇編碼主要免疫蛋白的基因序列。TGEV的纖突糖蛋白（S蛋白）攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是惟一能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)的結(jié)構(gòu)蛋白，并在決定宿主細(xì)胞親嗜性、致病性、細(xì)胞融合、血凝作用等方面起重要作用，是其主要的免疫源。纖突糖蛋白的A和D位點(diǎn)高度保守，且都在誘導(dǎo)中和抗體過程中起主要作用。因此用S基因的AD片段就可以介導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。

3.2 表達(dá)載體的選擇

乳酸菌作為人和動(dòng)物機(jī)體胃腸道中的正常菌群，在維持機(jī)體正常的生理功能和疾病預(yù)防過程中起著不可替代的作用，使它成為口服疫苗最具潛力的候選者[6-7]。它能夠調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道內(nèi)的正常菌群，在腸道上皮細(xì)胞上的黏附和定植能力能抵抗致病菌的定植和繁殖；它對一些腐敗菌、低溫細(xì)菌和腐敗產(chǎn)物如內(nèi)毒素的產(chǎn)生有較好的抑制作用，可用于防治腹瀉、下痢、腸炎、便秘和由于腸道功能紊亂引起的多種疾病以及皮膚炎癥等；它可以降低血清膽固醇、制造營養(yǎng)物質(zhì)、刺激組織發(fā)育，從而對機(jī)體的生理功能、營養(yǎng)狀況、藥物效應(yīng)、免疫反應(yīng)等有非特異性和特異性的免疫增強(qiáng)。它一方面由于能定植在腸道，既具有靶向的作用，又等同于天然自動(dòng)免疫；另一方面能明顯激活腹膜巨噬細(xì)胞的吞噬作用，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，促進(jìn)細(xì)胞分裂、產(chǎn)生抗體及細(xì)胞免疫等增強(qiáng)機(jī)體的反應(yīng)，提高機(jī)體的抗病能力。

豬傳染性胃腸炎是一種腸道傳染病，病毒感染具有明顯的腸嗜性，通過口服疫苗免疫，激發(fā)腸道黏膜免疫反應(yīng)是預(yù)防該病較為理想的途徑。近年來，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的日漸發(fā)展，基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)的日漸應(yīng)用，TGEV疫苗的研究也進(jìn)入了迅猛發(fā)展期，并在很多領(lǐng)域內(nèi)取得不俗的成果，為其在實(shí)際生活中的應(yīng)用做好了準(zhǔn)備，提供了更堅(jiān)實(shí)可靠的依據(jù)。

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2014-12-15

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20140101030JC）

*通訊作者

黃海楠，女，1981年生，博士，副研究員。