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        一種共沉淀回收構(gòu)建載體的新方法

        2015-12-22 01:49:44朱宏波廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院廣東湛江524088
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年13期
        關(guān)鍵詞:雙酶條帶克隆

        孔 昆,陶 園,朱宏波(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣東湛江524088)

        在基因工程和分子生物學(xué)研究中,載體構(gòu)建是一種常用的技術(shù)[1-2],傳統(tǒng)載體構(gòu)建方法需要進(jìn)行雙酶切得到目的片段和目標(biāo)載體,再通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化。隨著載體構(gòu)建技術(shù)的研究深入,人們開發(fā)出了多種方法來快速構(gòu)建載體。鄺翡婷等[3]利用重組融合PCR的方式快速獲得一些陽性克隆;歐陽平等[4]利用添加同源序列并通過一步克隆的方法也成功構(gòu)建了4個(gè)載體;陸云華等[5]利用定點(diǎn)表達(dá)載體pRSMGA對(duì)水稻多片段進(jìn)行拼接,提供了一種通用、有效構(gòu)建復(fù)雜載體的方法。而由Invitrogen公司開發(fā)的基因克隆Gateway技術(shù)可以快速、高效地將目的基因同時(shí)構(gòu)建到多種與其兼容的載體系統(tǒng)中,可進(jìn)行基因的蛋白質(zhì)表達(dá)和功能分析[6-7]。而傳統(tǒng)載體構(gòu)建過程中,切膠回收方法的優(yōu)點(diǎn)是可以清楚切取目標(biāo)條帶,排除其他因素對(duì)連接的干擾;但由于酶切最適時(shí)間確定困難或手工切膠造成的誤差,使得載體構(gòu)建的難度非常大。筆者利用乙醇可以使酶切反應(yīng)中的內(nèi)切酶變性失活的特性對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化[8],再將得到的混合沉淀溶解進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化,從而快速獲得了陽性克隆,載體構(gòu)建成功。

        1 材料與方法

        1.1 材料 pCambia1301質(zhì)粒由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子植物育種實(shí)驗(yàn)室保存;PTD-cry3Aa基因由上海生工生物工程股份有限公司合成連接在pUC57載體上;大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞由筆者制備。

        1.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 植物表達(dá)載體pCambia1301,大小12 kb,多克隆位點(diǎn)上游帶有CaMV35S啟動(dòng)子,下游帶有GUS報(bào)告基因,可進(jìn)行Kanamicin抗性篩選。而pUC57質(zhì)粒上則帶有目的基因cry3Aa,cry3Aa基因是蘇云金芽孢桿菌抗鞘翅目昆蟲的一類殺蟲基因,全長1 989 bp。利用BamHI和SalI雙酶切帶有cry3Aa基因片段的pUC57質(zhì)粒,協(xié)下的Cry3Aa基因片段連接到同樣由Bam HI和SalI 2種酶協(xié)割后的載體pCambia1301上,構(gòu)建植物表達(dá)載體pCambia1301-cry3Aa(圖1),將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,按常規(guī)方法提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR反應(yīng)及酶切鑒定。其具體操作見圖1。

        1.2.1 植物表達(dá)載體pCambia1301-cry3Aa酶切及回收。酶切反應(yīng)體系:pCambia1301 20 μl+Buffer(H)5 μl+BamHI 0.5 μl+SalI 0.5 μl+ddH2O 24 μl;pUC57 30 μl+Buffer(H)5 μl+BamHI 0.5+SalI 0.5 μl+ddH2O 14 μl,2 種酶切體系的反應(yīng)體積均為50 μl,37℃下酶切6 h。待酶切結(jié)束后將酶切產(chǎn)物pCambia1301和pUC57-cry3Aa進(jìn)行混合,加入2倍體積冰凍的無水乙醇和1/10體積的3 mol/L醋酸鈉,冰凍15 min,12 000 r/min離心5 min,沉淀即為回收片段。

        1.2.2 植物表達(dá)載體pCambia1301-cry3Aa連接及轉(zhuǎn)化。目的片段與pCambia1301載體的連接體系為:沉淀產(chǎn)物28 μl+T4DNA Ligase 2 μl+DNA Ligase Buffer 3.5 μl+ddH2O 1.5 μl。16℃連接12 h,連接過夜的產(chǎn)物10 μl加入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化方法為熱激轉(zhuǎn)化法,具體步驟:10 μl連接產(chǎn)物加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中→冰浴30 min→42℃熱激85 s→冰置2 min→加入890 μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基,37℃,200 r/min,45 min→4 ℃,8 000 r/min,30 s→棄 850 μl上清液,沉淀混勻,剩余菌液涂布到含50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)16~20 h后觀察菌落數(shù)。

        1.3 植物表達(dá)載體pCambia1301-cry3Aa檢測(cè)

        1.3.1 PCR檢測(cè)。根據(jù)GenBank公布cry3Aa基因序列,應(yīng)用Primer Premier 6.0軟件分析設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物,上游引物序列為:5'ACAACAGATGAACCTCTTGA 3',下游引物序列為:5'CGAATGGTGTGCTGAAAC 3'。可擴(kuò)增出463 bp的片段,引物由上海Sangon合成。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。

        1.3.2 酶切檢測(cè)。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后得到的陽性條帶,提取對(duì)應(yīng)質(zhì)粒,再用BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 載體酶切及沉淀 對(duì)BamHI和SalI酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,結(jié)果見圖2,由圖2可知,pCambia1301質(zhì)粒和pUC57-cry3Aa分別得到12 000、2 700、2 000 bp載體片段,與預(yù)計(jì)目標(biāo)條帶大小一致;將2個(gè)酶切產(chǎn)物進(jìn)行混合共沉淀回收得到3條清晰條帶,由上至下分別為pCambia1301、pUC57、cry3Aa,其大小與酶切結(jié)果一致(圖3)。

        2.2 植物表達(dá)載體的PCR鑒定 獲得21個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖4)經(jīng)菌落PCR發(fā)現(xiàn),8、9兩孔可以擴(kuò)增出長463 bp左右的片段,與陽性對(duì)照一致,而陰性對(duì)照(空白)卻未見該目的條帶(圖5),其陽性率達(dá)10%。

        2.3 植物表達(dá)載體的酶切鑒定 用BamHI和SalI雙酶切鑒定pCambia1301-cry3Aa質(zhì)粒,酶切得到12 000 bp pCambia1301載體和2 000 bp cry3Aa的片段,與預(yù)期大小一致;經(jīng)過2次鑒定說明該植物表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖6)。

        3 結(jié)論與討論

        伴隨著植物基因工程技術(shù)的日益完善,植物表達(dá)載體構(gòu)建將會(huì)以更加迅猛的趨勢(shì)發(fā)展,發(fā)展方向則是操作更加簡(jiǎn)便,適用范圍更加廣泛,且更加經(jīng)濟(jì)、有效。發(fā)展的大方向則是多種方法與 Gateway技術(shù)結(jié)合應(yīng)用[9-10]。該研究表明,對(duì)比傳統(tǒng)的酶切產(chǎn)物切膠回收以及另外幾種相對(duì)成熟的載體構(gòu)建技術(shù),酶切產(chǎn)物沉淀回收的方法是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)易、快捷的載體構(gòu)建方法;其經(jīng)濟(jì)體現(xiàn)在:混合沉淀回收的方法省去購買試劑盒的費(fèi)用,節(jié)省了財(cái)力;其簡(jiǎn)易體現(xiàn)在:回收的方法省去切膠回收繁瑣的步驟,使構(gòu)建過程更加快速。雖然混合沉淀回收過程中會(huì)造成載體自連,目的基因與非目標(biāo)載體連接的情況,但操作簡(jiǎn)單易行,對(duì)下一步連接試驗(yàn)沒有任何影響[11],且得到的菌落經(jīng)過菌液PCR基本可以去除假陽性的干擾,鑒定過程并不繁瑣;且該方法的陽性率可達(dá)10%以上,因此,該方法是一種非常有效的載體構(gòu)建方法,對(duì)于今后實(shí)驗(yàn)室載體構(gòu)建提供一種新的思路,更為今后的科研節(jié)省了成本,具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。

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