孔 昆，陶 園，朱宏波(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江524088)

在基因工程和分子生物學(xué)研究中，載體構(gòu)建是一種常用的技術(shù)［1－2］，傳統(tǒng)載體構(gòu)建方法需要進(jìn)行雙酶切得到目的片段和目標(biāo)載體，再通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化。隨著載體構(gòu)建技術(shù)的研究深入，人們開發(fā)出了多種方法來快速構(gòu)建載體。鄺翡婷等［3］利用重組融合PCR的方式快速獲得一些陽性克隆;歐陽平等［4］利用添加同源序列并通過一步克隆的方法也成功構(gòu)建了4個(gè)載體;陸云華等［5］利用定點(diǎn)表達(dá)載體pRSMGA對水稻多片段進(jìn)行拼接，提供了一種通用、有效構(gòu)建復(fù)雜載體的方法。而由Invitrogen公司開發(fā)的基因克隆Gateway技術(shù)可以快速、高效地將目的基因同時(shí)構(gòu)建到多種與其兼容的載體系統(tǒng)中，可進(jìn)行基因的蛋白質(zhì)表達(dá)和功能分析［6－7］。而傳統(tǒng)載體構(gòu)建過程中，切膠回收方法的優(yōu)點(diǎn)是可以清楚切取目標(biāo)條帶，排除其他因素對連接的干擾;但由于酶切最適時(shí)間確定困難或手工切膠造成的誤差，使得載體構(gòu)建的難度非常大。筆者利用乙醇可以使酶切反應(yīng)中的內(nèi)切酶變性失活的特性對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化［8］，再將得到的混合沉淀溶解進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，從而快速獲得了陽性克隆，載體構(gòu)建成功。

1 材料與方法

1.1 材料 pCambia1301質(zhì)粒由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子植物育種實(shí)驗(yàn)室保存;PTD-cry3Aa基因由上海生工生物工程股份有限公司合成連接在pUC57載體上;大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞由筆者制備。

1.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 植物表達(dá)載體pCambia1301，大小12 kb，多克隆位點(diǎn)上游帶有CaMV35S啟動(dòng)子，下游帶有GUS報(bào)告基因，可進(jìn)行Kanamicin抗性篩選。而pUC57質(zhì)粒上則帶有目的基因cry3Aa，cry3Aa基因是蘇云金芽孢桿菌抗鞘翅目昆蟲的一類殺蟲基因，全長1 989 bp。利用BamHI和SalI雙酶切帶有cry3Aa基因片段的pUC57質(zhì)粒，協(xié)下的Cry3Aa基因片段連接到同樣由Bam HI和SalI 2種酶協(xié)割后的載體pCambia1301上，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCambia1301-cry3Aa(圖1)，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR反應(yīng)及酶切鑒定。其具體操作見圖1。

1.2.1 植物表達(dá)載體pCambia1301-cry3Aa酶切及回收。酶切反應(yīng)體系:pCambia1301 20 μl+Buffer(H)5 μl+BamHI 0.5 μl+SalI 0.5 μl+ddH2O 24 μl;pUC57 30 μl+Buffer(H)5 μl+BamHI 0.5+SalI 0.5 μl+ddH2O 14 μl，2 種酶切體系的反應(yīng)體積均為50 μl，37℃下酶切6 h。待酶切結(jié)束后將酶切產(chǎn)物pCambia1301和pUC57-cry3Aa進(jìn)行混合，加入2倍體積冰凍的無水乙醇和1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，冰凍15 min，12 000 r/min離心5 min，沉淀即為回收片段。

1.2.2 植物表達(dá)載體pCambia1301-cry3Aa連接及轉(zhuǎn)化。目的片段與pCambia1301載體的連接體系為:沉淀產(chǎn)物28 μl+T4DNA Ligase 2 μl+DNA Ligase Buffer 3.5 μl+ddH2O 1.5 μl。16℃連接12 h，連接過夜的產(chǎn)物10 μl加入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法為熱激轉(zhuǎn)化法，具體步驟:10 μl連接產(chǎn)物加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中→冰浴30 min→42℃熱激85 s→冰置2 min→加入890 μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min，45 min→4 ℃，8 000 r/min，30 s→棄 850 μl上清液，沉淀混勻，剩余菌液涂布到含50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～20 h后觀察菌落數(shù)。

1.3 植物表達(dá)載體pCambia1301-cry3Aa檢測

1.3.1 PCR檢測。根據(jù)GenBank公布cry3Aa基因序列，應(yīng)用Primer Premier 6.0軟件分析設(shè)計(jì)一對檢測引物，上游引物序列為:5'ACAACAGATGAACCTCTTGA 3'，下游引物序列為:5'CGAATGGTGTGCTGAAAC 3'?？蓴U(kuò)增出463 bp的片段，引物由上海Sangon合成。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。

1.3.2 酶切檢測。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后得到的陽性條帶，提取對應(yīng)質(zhì)粒，再用BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體酶切及沉淀 對BamHI和SalI酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖2，由圖2可知，pCambia1301質(zhì)粒和pUC57－cry3Aa分別得到12 000、2 700、2 000 bp載體片段，與預(yù)計(jì)目標(biāo)條帶大小一致;將2個(gè)酶切產(chǎn)物進(jìn)行混合共沉淀回收得到3條清晰條帶，由上至下分別為pCambia1301、pUC57、cry3Aa，其大小與酶切結(jié)果一致(圖3)。

2.2 植物表達(dá)載體的PCR鑒定 獲得21個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖4)經(jīng)菌落PCR發(fā)現(xiàn)，8、9兩孔可以擴(kuò)增出長463 bp左右的片段，與陽性對照一致，而陰性對照(空白)卻未見該目的條帶(圖5)，其陽性率達(dá)10%。

2.3 植物表達(dá)載體的酶切鑒定 用BamHI和SalI雙酶切鑒定pCambia1301-cry3Aa質(zhì)粒，酶切得到12 000 bp pCambia1301載體和2 000 bp cry3Aa的片段，與預(yù)期大小一致;經(jīng)過2次鑒定說明該植物表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖6)。

3 結(jié)論與討論

伴隨著植物基因工程技術(shù)的日益完善，植物表達(dá)載體構(gòu)建將會(huì)以更加迅猛的趨勢發(fā)展，發(fā)展方向則是操作更加簡便，適用范圍更加廣泛，且更加經(jīng)濟(jì)、有效。發(fā)展的大方向則是多種方法與 Gateway技術(shù)結(jié)合應(yīng)用［9－10］。該研究表明，對比傳統(tǒng)的酶切產(chǎn)物切膠回收以及另外幾種相對成熟的載體構(gòu)建技術(shù)，酶切產(chǎn)物沉淀回收的方法是一種經(jīng)濟(jì)、簡易、快捷的載體構(gòu)建方法;其經(jīng)濟(jì)體現(xiàn)在:混合沉淀回收的方法省去購買試劑盒的費(fèi)用，節(jié)省了財(cái)力;其簡易體現(xiàn)在:回收的方法省去切膠回收繁瑣的步驟，使構(gòu)建過程更加快速。雖然混合沉淀回收過程中會(huì)造成載體自連，目的基因與非目標(biāo)載體連接的情況，但操作簡單易行，對下一步連接試驗(yàn)沒有任何影響［11］，且得到的菌落經(jīng)過菌液PCR基本可以去除假陽性的干擾，鑒定過程并不繁瑣;且該方法的陽性率可達(dá)10%以上，因此，該方法是一種非常有效的載體構(gòu)建方法，對于今后實(shí)驗(yàn)室載體構(gòu)建提供一種新的思路，更為今后的科研節(jié)省了成本，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。

［1］OHSUGI T，KUMASAKA T，URANO T.Construction of a full-length human T cell leukemia virus type I genome from MT－2 cells containing multiple defective proviruses using overlapping polymerase chain reaction［J］.Analytical Biochemistry，2004，329(2):281 －288.

［2］TENNO T，GODA N，TATEISHI Y，et al.High-throughput construction method for expression vector of peptides for NMR study suited for isotopic labeling［J］.Protein Engineering Design and Selection，2004，17(4):305 －314.

［3］鄺翡婷，袁定陽，李莉，等.一種載體構(gòu)建的新方法:重組融合PCR法［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013，31(6):634 －639.

［4］歐陽平，李玉，嚴(yán)紅，等.一種載體構(gòu)建的新方法:一步克隆法［J］.湖北大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，29(2):178 －181.

［5］陸云華，馬立新，蔣思婧.一種通用高效的復(fù)雜載體構(gòu)建的新方法［J］.遺傳，2006，28(2):212 －218.

［6］HARTLEY J L，TEMPLE G F，BRASCH M A.DNA cloning using in vitro site-specific recombination［J］.Genome Research，2000，10(11):1788 －1795.

［7］林春晶，韋正乙，蔡勤安，等.幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法［J］.生物技術(shù)，2008，18(5):84 －87.

［8］CROWE J，COOPER H J，SMITH M A，et al.Improved cloning efficiency of polymerase chain reaction(PCR)products after proteinase K digestion［J］.Nucleic Acids Research，1991，19(1):184.

［9］TZFIRA T，TIAN G W，LACROIX B，et al.pSAT vectors:a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants［J］.Plant Molecular Biology，2005，57(4):503 －516.

［10］EARLEY K W，HAAG J R，PONTES O，et al.Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics［J］.The Plant Journal，2006，45(4):616－629.

［11］羅立廷，王玨，姚琴，等.一種有效回收短片段PCR產(chǎn)物的方法［J］.生物技術(shù)，2006，16(3):47 －48.