吳方評，蒲艷春(湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南懷化418000)

廣東紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun)為馬鞭草科(Verbenaceae)紫珠屬(Callicarpa L.)植物，別名萬年青、珍珠風(fēng)、臭常山、老鴉飯、金刀菜等，生于海拔300～1 600 m的山坡灌木叢或山地，主要分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、貴州、云南等地，收載于2010版中國藥典［1］。廣東紫珠地上部分均可入藥，其性味苦、澀、涼，具有收斂止血、清熱解毒和散瘀的作用，用于濕熱黃疸、脅痛不適等癥。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，紫珠中含有黃酮、酚酸、三萜和苯丙素等類別化合物［2－5］，總黃酮部位是其抗宮頸炎有效部位［6］，三萜部位主要含齊墩果酸和熊果酸等成分［7－8］，有良好的護(hù)肝作用和對肝臟的抗脂質(zhì)過氧化(LPO)作用［9－10］，目前，廣東紫珠護(hù)肝產(chǎn)品市場鮮有報道。該試驗(yàn)采用高效液相色譜法首次對不同產(chǎn)地、不同部位和不同采收期廣東紫珠中齊墩果酸和熊果酸的含量進(jìn)行同時測定，為廣東紫珠種植時地理?xiàng)l件、采收部位和適宜采收時間的選擇提供指導(dǎo)，也為廣東紫珠資源的合理開發(fā)和綜合評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。10個批次的廣東紫珠主要采摘于湖南和江西2個產(chǎn)區(qū)，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化研究中心汪冶教授鑒定為馬鞭草科植物紫珠。

1.1.2 主要儀器。Agilent1260高效液相色譜儀，G1311B四元泵(帶在線脫氣機(jī))，G4212B DAD陣列二極管檢測器，Agilent漢化版色譜工作站，迪馬 Diamonil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱;電子分析天平(島津 AUW120D);超聲波中藥處理機(jī)(LC－350A)。

1.1.3 主要試劑。齊墩果酸對照品(批號110709－201206，供含量測定用)和熊果酸對照品(批號110742－201220，供含量測定用)，由中國藥品生物制品檢定研究院提供;甲醇和乙腈為色譜純(天津賽福瑞科技有限公司);水為重蒸水;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜分析條件。色譜柱為迪馬Diamonil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈 － 水(95∶5)，流速 0.5 ml/min，進(jìn)樣量 10 μl，檢測波長210 nm。

1.2.2 對照品溶液的制備。分別精確稱取齊墩果酸4.0 mg、熊果酸4.6 mg于10 ml容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得0.40 mg/ml齊墩果酸儲備液和0.46 mg/ml熊果酸儲備液。

1.2.3 供試品溶液的制備。分別稱取樣品粉末(過40目篩)0.1 g于10 ml容量瓶中，加入甲醇約8 ml，放入超聲波中藥處理機(jī)中處理45 min，取出，放置室溫，用甲醇定容至刻度，進(jìn)樣前用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。分別吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，在“1.2.1”色譜條件下，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2 線性關(guān)系的考察。分別精密量取 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml的齊墩果酸和熊果酸于 10 ml容量瓶，用甲醇定容至刻度，即得 4.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 μg/ml齊墩果酸系列濃度校正液和 4.6、23.0、46.0、69.0、92.0、115.0、138.0 μg/ml熊果酸系列濃度校正液，按照“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣，以濃度 X(μg/ml)為橫坐標(biāo)、面積響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，分別計算齊墩果酸和熊果酸線性回歸方程。

1.2.4.3 檢測限和定量限的考察。將齊墩果酸和熊果酸對照品溶液逐步稀釋后進(jìn)樣測定，以色譜圖中信噪比(S/N)為3時的進(jìn)樣量為最低檢測限(LOD)，信噪比(S/N)為10時的進(jìn)樣量為最低定量限(LOQ)。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試樣品溶液，按“1.2.1”色譜分析條件分別于 0、1、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，進(jìn)樣量 10 μl，測定峰面積積分值，計算RSD。

1.2.4.5 精密度試驗(yàn)。取按“1.2.3”方法制備的供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣7次，計算峰面積的RSD值。

1.2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取0.1 g同一批次的廣東紫珠樣品7 份，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件分析，測定峰面積，計算平均含量和RSD。

1.2.4.7 加樣回收試驗(yàn)。精密稱取同批次已知含量(齊墩果酸0.241 4 mg/g，熊果酸0.694 4 mg/g)的廣東紫珠6份，分別置于10 ml容量瓶中，并加入齊墩果酸和熊果酸，按照“1.2.3”處理、“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，測定齊墩果酸和熊果酸的含量，計算回收率。

1.2.5 樣品的含量測定。精確稱取不同產(chǎn)地廣東紫珠藥材10批、不同采收期樣品5批，每批藥材取5個平行樣，按照“1.2.3”進(jìn)行樣品處理、“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，用外標(biāo)法分別對齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1表明，在“1.2.4.1”條件下，樣品色譜圖中齊墩果酸和熊果酸的保留時間分別為16.378和16.932 min，色譜柱的理論塔板數(shù)大于6 000，分離度約為1.5，齊墩果酸和熊果酸基線基本能夠分離，峰形對稱，表明此色譜條件可用于齊墩果酸和熊果酸的同時分析。

2.1.2 線性關(guān)系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，以進(jìn)樣濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)計算得出齊墩果酸和熊果酸線性回歸方程分別為Y=5.070 5X－2.268 4(R2=0.999 7)、Y=4.081 4X+1.066 2(R2=0.999 3)，表明齊墩果酸和熊果酸分別在0.040 0 ～1.200 0、0.046 0 ～1.380 0 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.1.3 檢測限和定量限的考察。按“1.2.4.3”方法操作，結(jié)果表明，齊墩果酸和熊果酸的檢測限分別為0.001 6和0.002 1 μg，定量限分別為 0.005 4 和 0.005 8 μg。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計算得出齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.73%和1.95%，表明樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.5”方法操作，齊墩果酸和熊果酸對照品峰面積的RSD分別為0.94%和1.13%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.6”方法操作，測得齊墩果酸和熊果酸含量分別為 0.241 4、0.694 4 mg/g，RSD 分別為1.95%和2.31%(n=7)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn)。由表1～2可見，齊墩果酸、熊果酸的平均回收率分別為98.90%、98.75%，RSD分別為0.64%、0.55%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于廣東紫珠中齊墩果酸和熊果酸的含量測定。

表1 廣東紫珠中齊墩果酸的精密度和回收率試驗(yàn)

2.2 含量測定 從表3～4可以看出，不同產(chǎn)地廣東紫珠樣品中齊墩果酸和熊果酸含量以江西萍鄉(xiāng)種植果實(shí)為最高，分別達(dá)0.469 9和1.404 8 mg/g，江西萍鄉(xiāng)收割后幼苗中齊墩果酸和熊果酸的含量也較高，分別達(dá)0.379 4和1.041 4 mg/g;不同采收期廣東紫珠樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量以11月初為最高。

表2 廣東紫珠中熊果酸的精密度和加樣回收率試驗(yàn)

表3 不同產(chǎn)地廣東紫珠樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量

表4 不同采收期廣東紫珠樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量

3 結(jié)論與討論

3.1 藥材質(zhì)量控制標(biāo)志物選擇的考量 廣東紫珠為2010版藥典收藏藥材，以連翹酯苷B和金石蠶苷為標(biāo)識物來評價廣東紫珠的質(zhì)量，如開發(fā)出相關(guān)的護(hù)肝產(chǎn)品，該方法選用齊墩果酸和熊果酸作為對該產(chǎn)品質(zhì)量控制的標(biāo)識物有一定的意義。

3.2 流動相的選擇 試驗(yàn)過程中試用了不同的流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動相為乙腈∶水=95∶5時峰形對稱，出峰時間適宜，雜質(zhì)峰對被檢測峰干擾小。因此，試驗(yàn)采用乙腈∶水=95∶5作為流動相。

3.3 提取方法和提取溶劑的優(yōu)選 該試驗(yàn)采用乙醇、95%乙醇、50%乙醇、甲醇和50%甲醇作為超聲提取溶劑，結(jié)果表明，用乙醇作為提取溶劑在檢測時會出現(xiàn)較大溶劑峰，用50%甲醇作為提取溶劑提取耗時過長。該試驗(yàn)采用甲醇作為提取溶劑，超聲提取45 min，待測物基本能提取完全。

3.4 藥材采收方式的選擇 從不同產(chǎn)地樣品的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，江西萍鄉(xiāng)種植的廣東紫珠中齊墩果酸和熊果酸的含量較高;采收后第2年新長成的幼苗與頭年采收的果實(shí)樣品相比，齊墩果酸和熊果酸的含量普遍偏高;從不同采收期樣品分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11月初采收的廣東紫珠齊墩果酸和熊果酸的含量較高。以上分析結(jié)果對廣東紫珠藥材的種植環(huán)境、采收時間等的選擇有一定的指導(dǎo)作用，對廣東紫珠藥材資源的開發(fā)和合理利用也有一定的意義。

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