王 雙 (山西大地復墾環(huán)保工程設計有限公司，山西太原030000)

高濃度含酚廢水(苯酚濃度高于500 mg/L)過去一直采用物理回收處理，但由于存在溶劑損失、吸附劑再生困難等原因而不經濟，并且還會產生二次污染。相對于物理回收處理的方法而言，生物法具有經濟、高效、無二次污染等優(yōu)點，利用生物強化技術的微生物菌群高效分解能力，降解細菌的應用已經越來越多地受到人們的重視［1－6］。

近幾十年的研究表明，有很多微生物參與了有毒有機污染物的降解，所研究的這些微生物中對含酚類污染物有明顯降解作用的經鑒定主要有以下幾種:藻類(Alga Ochromaonas)、酵母菌(Yeast trichosporon)、根瘤菌(Rhizobia)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、反硝化菌(Denitrifying bactreia)、真養(yǎng)產堿菌(Alcaligens eutrophus)、有假單胞菌(Pesudonomas sp.)、醋酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)等菌屬［7］。

例如楊彥希等就從煉油廠嚴重污染的污水和土壤中分離篩選到12株假絲酵母及絲胞酵母能以苯酚為唯一碳源生長，24～28 h內降解苯酚質量濃度最高可達1 200 mg/L以上，其中一菌株降解苯酚質量濃度最高可達1 700 mg/L［8］。李焱采用雙親滅活原生質體融合技術選育出一株高效苯酚降解菌株，定名為Pseudomonas stutzri JFL 2008，比出發(fā)菌株降解苯酚能力提高20%，能降解苯酚的最高濃度為1 800 mg/L［9］。狄軍貞篩選出的假單胞菌GPS-1在2 000 mg/L的高苯酚濃度下，15 h降解率達93.16%［10］。從以上的試驗可知，通過篩選菌株引入高降解活性菌種能提高含酚廢水的降解率，但如何使這些優(yōu)良菌株長期的在生物處理系統中占優(yōu)勢并保持其高降解活性是要解決的主要問題，而且提高降解速率是生物處理含酚廢水的一個關鍵問題。

1 材料與方法

1.1 菌源 取自中煤龍華哈爾濱煤化工有限公司廢水處理系統的活性污泥。

1.2 培養(yǎng)基 無機培養(yǎng)基:MgSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·H2O 0.1 g、MnSO4·H2O 0.1 g、CaCl20.2 g、K2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、(NH4)2SO40.45 g、NaCl 0.1 g、葡萄糖 2 g、水1 000 ml;有機培養(yǎng)基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、水1 000 ml、調節(jié)pH 7±1(若制備固體培養(yǎng)基則加入瓊脂20 g);篩選培養(yǎng)基:MgSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·H2O 0.1 g、MnSO4·H2O 0.1 g、CaCl20.2 g、K2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、(NH4)2SO40.45 g、NaCl 0.1 g、酚、調節(jié) pH 7 ±1。

1.3 試驗儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，CHA-S氣浴恒溫振蕩器，YXQ·SG46·280SA手提式壓力蒸汽滅菌器，精密電子天平，CJ-1D潔凈工作臺，PHS-3C精密pH計，721分光光度計。

1.4 滅菌條件 ①高壓蒸汽滅菌:小件玻璃器皿、培養(yǎng)基等采用濕式高壓蒸汽滅菌。這種滅菌方式可以達到徹底的滅菌。滅菌條件:0.103 MPa，121℃，20 min。②紫外滅菌無菌操作臺:采用紫外滅菌方式，用紫外燈滅菌30 min。該種方式對空氣進行滅菌，操作簡單方便，效果不錯。

1.5 酚降解菌株的篩選 目前，所進行試驗研究的大部分優(yōu)勢降酚菌種主要以單一一種酚為基質進行篩選，而在實際應用中單一酚的情況比較少，取而代之的則是混合酚的基質條件，這樣致使所獲得菌種在實際應用中對混合酚耐受力差，適應其環(huán)境緩慢，降解率不能得到快速提高，在實際應用中效果大打折扣，遠不如在試驗小試時得到的去除率效果明顯。在以實際工程為依據的基礎上，該試驗將苯酚、甲基酚、二甲基苯酚、苯二酚按照30∶10∶10∶25的比例來配制篩選培養(yǎng)基，得到了一株能夠適應高酚及混合酚條件的菌株。篩選過程如下:

取中煤龍華哈爾濱煤化工有限公司廢水處理系統的污泥廢水混合物，此時的廢水水質:COD 1 180 mg/L、酚濃度855 mg/L、氨氮濃度45.88 mg/L、pH 7±1、溫度35 ～40 ℃，取此廢水1 000 ml并在35℃的條件下曝氣48 h。將曝氣48 h后的泥水混合物沉降30 min，取上層澄清后的菌懸液100 ml，按照篩選培養(yǎng)基的比例投加藥劑，攪拌均勻，在氣浴恒溫振蕩器中以30℃、150 r/min的速度恒溫振蕩24 h。24 h后取振蕩的菌懸液10 ml投加到濃度為200 mg/L的篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)在30℃、150 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。重復上一步操作，每次增加篩選培養(yǎng)基中酚濃度200 mg/L，直至達到1 000 mg/L。取經過1 000 mg/L高酚濃度篩選后的菌懸液，利用有機固體培養(yǎng)基進行平板劃線分離純化培養(yǎng)直至獲得單個菌落。將所獲得的單個菌落進行有機富集培養(yǎng)。

1.6 酚降解菌株的分子鑒定 微生物分子生態(tài)學與傳統的以純培養(yǎng)為基礎的技術相比較，最明顯的一個優(yōu)勢在于微生物分子生態(tài)學是利用分子生物學的方法，直接提取環(huán)境樣品中的總DNA，然后在分子的水平上對其微生物區(qū)系進行解析。隨著16S rDNA方法的發(fā)展，它逐漸被應用于對環(huán)境樣品的微生物進行鑒定和分類［11－13］，但是環(huán)境樣品和純培養(yǎng)樣品相比成分更加復雜，提取DNA和雜交等試驗的要求條件更加苛刻。而與16S rDNA比較，16S rRNA基因序列為1 550 bp左右，由保守區(qū)和可變區(qū)組成，通常編碼酶的基因不像16S rRNA基因這樣具有不可替代的作用，因此16S rRNA基因在進化上相對保守，并且由于16S rRNA基因在細菌中是普遍存在的，所以可以通過對比其序列的相似性來鑒定它們之間的親緣關系［14］。目前，16S rRNA基因序列和功能基因序列被廣泛地用來進行微生物多樣性的研究，該技術已發(fā)展成為純培養(yǎng)微生物以及環(huán)境微生物分類和鑒定的一個有力工具。對于純化培養(yǎng)后降解酚優(yōu)勢菌，用PCR方法擴增分離菌株的16S rRNA基因，插入pUCm－T載體(上海生工公司)，轉化E.coli DH5α送某公司測序，所得序列與GenBank的16S rRNA基因序列進行blast比對，初步確定其屬名。所用PCR引物:27F，5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3';1492R，5'-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3'［15］。PCR 反 應條件見文獻［16］。經測序確定其屬名后知，篩選出來的降解酚優(yōu)勢菌株為Stenotrophomonas maltophilia K279，在下文中簡寫為 S.maltophilia K279。

2 試驗結果

2.1 菌落特征 取S.maltophilia K279的菌懸液，并將其制備成10－6、10－7稀釋度的菌懸液，配制有機固體培養(yǎng)基，用無菌玻璃涂棒在固體培養(yǎng)基上均勻地涂布，室溫下靜置5 min后，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。如圖1所示，即為24 h后所生長的S.maltophilia K279的菌落特征。

從圖1可知，S.maltophilia K279菌落呈淡黃色，單個菌落呈近似圓形，有些許光澤，質地粘稠，菌落略突出于培養(yǎng)基表面且表面濕潤易于挑起接種。由圖1b可知，菌落邊緣較為平整光滑，個別有略微小鋸齒狀。

2.2 菌株特征 微生物細胞的形狀、大小、鞭毛、莢膜等都是微生物形態(tài)的重要特征，由于菌體很小，只能在顯微鏡下進行觀察測定。取固體純培養(yǎng)3 d的S.maltophilia K279，用接種環(huán)挑取少許菌落至于載玻片(載玻片用前需浸泡1 d，以減少對顯微鏡觀察的干擾)上，并滴少量滅菌蒸餾水使載玻片上的菌落得到充分稀釋，待水分蒸發(fā)后，用原子力顯微鏡對其進行觀察測定。

如圖2所示，從所拍下的單個細菌細胞的圖片可以清楚地觀察到，S.maltophilia K279為短桿菌，形狀呈橢圓狀，無鞭毛無莢膜。原子力顯微鏡拍攝后的圖片可以在Nanoscope 5.30r3sr3軟件上進行大小的測定。圖3即是在Nanoscope 5.30r3sr3軟件上進行相關測定后所拍下的單個細菌的長寬圖片，由軟件測得 S.maltophilia K279長為 66.591 nm;寬為59.963 nm。

2.3 菌株生長曲線 配制50 ml有機培養(yǎng)基，向其中加入S.maltophilia K279菌懸液10 ml，在氣浴恒溫振蕩器中以30℃、150 r/min的條件恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔2 h測定一次其吸光度，連續(xù)測定24 h。圖4為連續(xù)測定24 h后所作出的S.maltophilia K279生長曲線圖。

如圖4所示，曲線走勢為較光滑上升式曲線，說明S.maltophilia K279的生長整體呈上升趨勢，隨著時間的增加其生長速度也隨之加快。生長曲線可分為3個階段，第一階段是0～4 h，此時為緩慢生長階段，吸光度值僅從7.00增加到12.90。第二階段是快速生長階段，在生長到6 h時吸光度值已經達到了1.20×20(×20表示菌液稀釋了20倍，下同)，近似于2 h測定時的3倍，4 h測定時的兩倍。因此，從此時開始細菌進入快速生長階段。第三階段即為穩(wěn)定生長階段，在 S.maltophilia K279 生長16 h時，吸光度值為3.85 ×20，細菌的生長開始進入穩(wěn)定高峰期，隨后細菌生長達到了一個穩(wěn)定的過程，吸光度值介于3.85×20～4.05×20之間，有較小的波動，保持著高效穩(wěn)定的生長勢頭。由此說明，S.maltophilia K279在培養(yǎng)生長16 h以后，將進入一個相對穩(wěn)定的生長階段。

3 結論

以中煤龍華哈爾濱煤化工有限公司廢水處理系統的活性污泥為試驗用污泥。通過從中煤龍華哈爾濱煤化工有限公司廢水處理系統中取得的污泥廢水混合物中提取菌懸液，并經過含高濃度酚的培養(yǎng)液進行優(yōu)勢菌的篩選培養(yǎng)，通過平板純化手段分離出單一菌株，對分離出的純菌株進行馴化、富集培養(yǎng)。所培養(yǎng)出的降酚優(yōu)勢菌經過PCR擴增分離菌株的16S rRNA基因序列來進行其分子鑒定，鑒定結果確定此優(yōu)勢菌的屬名為Stenotrophomonas maltophilia K279。對優(yōu)勢菌S.maltophilia K279進行其相關性質的測定，通過固體培養(yǎng)觀察其基本的菌落特征，菌落略突出于培養(yǎng)基表面且表面濕潤易于挑起接種，顏色呈淡黃色，近似圓形且菌落邊緣較平整光滑，個別有微鋸齒狀出現，菌落有些許光澤并且質地粘稠。在原子力顯微鏡下拍攝單個細菌的圖片中，顯示出S.maltophilia K279是短桿、呈橢圓形狀、無鞭毛、無莢膜的細菌。利用 Nanoscope 5.30r3sr3軟件計算 S.maltophilia K279單個細菌的大小，得出細菌長為66.591 nm;寬為59.963 nm。在對此優(yōu)勢細菌的24 h生長培養(yǎng)中，生長曲線整體呈上升趨勢，大致分為緩慢生長、快速生長和穩(wěn)定生長3個階段，當經過16 h的生長培養(yǎng)后，細菌生長便進入其高峰期，并且生長穩(wěn)定，達到穩(wěn)定的生長階段。

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