劉紅陽　程顯好　王萌　李維煥

摘 要：為確定水解法定量測定肥料中聚谷氨酸（γ-PGA）含量的條件，優(yōu)化了水解時間，檢測了水解過程對谷氨酸的破壞情況，確定了水解法定量測定肥料中聚谷氨酸含量的參數(shù)條件。以水解法驗證了醇沉過程對聚谷氨酸的沉淀的程度。水解法測定聚谷氨酸含量簡單易行，結(jié)果可靠。

關(guān)鍵詞：聚谷氨酸；測定方法；定量分析；水解條件

中圖分類號：TQ922.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132006

γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA，或稱“聚麩胺酸”）是一種由芽孢桿菌屬微生物發(fā)酵產(chǎn)生的、具有水溶性的、可生物降解的高分子多聚合物[1]。聚谷氨酸具有較多側(cè)鏈，可以與多種基團(tuán)形成具有特殊性質(zhì)的復(fù)合物。由于其安全、無害、有良好的保濕性能，聚谷氨酸及其復(fù)合物常被用于醫(yī)藥[2]、食品、化妝品等[3]領(lǐng)域。在農(nóng)業(yè)上使用聚谷氨酸，有提高肥料的利用率，增加土壤保水性，絡(luò)合重金屬元素，緩沖鹽堿和pH，隔絕有害物質(zhì)，提高植物的抗病能力等作用。除此之外，其自然水解產(chǎn)生的谷氨酸也是多種動植物體內(nèi)重要化學(xué)反應(yīng)的參與物質(zhì)。

本實驗探究了使用水解的方法進(jìn)行聚谷氨酸含量的測定的相關(guān)條件。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

谷氨酸/葡萄糖/乳酸三合一標(biāo)準(zhǔn)液（100mg/dL）；L-谷氨酸、無水乙醇、甘油、鹽酸、NaOH等都為分析純試劑；臺灣味丹公司提供的聚谷氨酸樣品（液體）；臺灣味丹公司提供的聚谷氨酸高濃度樣品（固體）。

1.2 實驗儀器

SBA-40E生物傳感分析儀；pH 計；油浴鍋；離心機(jī)；電熱鼓風(fēng)干燥箱；電子天平。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

液體樣品先經(jīng)8000rpm離心20min，去除菌體等雜質(zhì)，取1ml上清液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，使用生物傳感分析儀測定游離谷氨酸的含量[4]。再取5ml上清液加入水解酸，110℃水解一定時間，水解液冷卻、中和至pH 5～8，定容至一定體積，使用生物傳感分析儀測定谷氨酸含量。

1.3.2水解時間的確定

取聚谷氨酸樣品進(jìn)行水解，每隔一定時間取樣，測定水解液中游離谷氨酸含量。

1.3.3水解過程對樣品中谷氨酸破壞的測定

用分析純的谷氨酸配制0.1g/ml的谷氨酸水溶液，分別取5ml加入7組蒸餾瓶中，進(jìn)行水解操作，在不同時間終止水解，測定水解液中游離谷氨酸的含量，比較谷氨酸量是否有降低。

1.3.4醇沉步驟對水解結(jié)果的影響

取離心后的聚谷氨酸樣品液30ml調(diào)至一定pH后，加入到3～5倍無水乙醇中，進(jìn)行醇沉沉淀并離心、烘干。將上一步所得沉淀用一定量的水溶解，再次進(jìn)行醇沉操作，如此往復(fù)，測定每一次烘干后的沉淀質(zhì)量。再將第一次醇沉過后的沉淀物加一定量水溶解至原始體積，進(jìn)行水解，另取同樣體積離心后的原液進(jìn)行直接水解，兩者進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解時間對水解結(jié)果的影響

對于味丹公司的聚谷氨酸液體肥料，利用18.5%鹽酸在110℃溫度下進(jìn)行水解實驗，每隔2h取樣測定水解結(jié)果，水解液中谷氨酸含量見表1。當(dāng)水解時間達(dá)到4h以后，谷氨酸含量不再升高。所以4h的水解時間能夠保證聚谷氨酸的水解完全。

2.2 水解過程對樣品中谷氨酸含量破壞的影響

氨基酸水解的常規(guī)方法是采用5.7mol/L的鹽酸在真空狀況下與110℃水解24h，也有在150℃快速水解90分鐘[5]。真空條件是為了隔絕氧氣，防止有些敏感氨基酸在高溫條件下氧化破壞。非真空條件下高溫水解，是否會對谷氨酸氧化破壞，以谷氨酸代替聚谷氨酸，模擬水解條件，測定水解過程中谷氨酸含量變化情況，探討谷氨酸是否發(fā)生變化。結(jié)果表明，谷氨酸有較好的穩(wěn)定性，在非真空條件下水解，其含量沒有發(fā)生改變。這說明水解過程中，不必采取真空條件。

2.3醇沉步驟對水解結(jié)果的影響

將液體的聚谷氨酸肥料成品進(jìn)行醇沉實驗，發(fā)現(xiàn)醇沉法不能完全沉淀液體中的聚谷氨酸，而且沉淀結(jié)果受pH值影響較大，每次沉淀都有20%左右的聚谷氨酸損失，經(jīng)過連續(xù)四次沉淀，聚谷氨酸幾乎損失殆盡，結(jié)果見圖1。因此使用醇沉法作為PGA測定方法，受很多因素影響，準(zhǔn)確度不夠。

圖1醇沉次數(shù)與沉淀量關(guān)系

將第一次醇沉過后的沉淀物加一定量水溶解至原始體積，進(jìn)行水解，另取同樣體積離心后的原液進(jìn)行直接水解，兩者進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

兩種方法測定結(jié)果差別在8%，但實際上醇沉法測定的聚谷氨酸中一方面攜帶了大分子蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，另一方面聚谷氨酸也能絡(luò)合許多金屬離子，所以沉淀稱重實際上遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其中所含的純聚谷氨酸的量。

2.4水解法與高效液相色譜法結(jié)論對比

將不同批次的產(chǎn)品進(jìn)行高效液相色譜法測定與水解法測定進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。

圖2 水解法與高效液相色譜法結(jié)果對比

高效液相色譜法所得結(jié)論與水解法結(jié)論相吻合，說明水解法具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

在定量測定聚谷氨酸的含量時，水解法具有簡便、快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)勢。水解過程對谷氨酸含量沒有破壞，也不需要抽真空封管水解。醇沉步驟會對水解后得出的含量數(shù)值產(chǎn)生影響，因此直接水解得到的結(jié)果比醇沉水解得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)

[1]石冬霞. γ-聚谷氨酸的微生物合成、分離純化及性質(zhì)與應(yīng)用研究[D]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)， 2010.

[2]Buescher J M， Margaritis A. Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in the biopharmaceutical， biomedical and food industries[J]. Crit Rev Biotechnol， 2007， 27（1）： 1-19.

[3]Bhat A R， Irorere V U， Bartlett T， et al. Improving survival of probiotic bacteria using bacterial poly-gamma-glutamic acid[J]. Int J Food Microbiol， 2015， 196： 24-31.

[4]張軼， 盧珂， 孟杰， et al. 谷氨酸分析儀測定發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸的實驗條件研究[J]. 食品研究與開發(fā)， 2007（12）： 132-135.

[5]張慶慶， 金鑫強(qiáng)， 陳劍翔， et al. 發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸含量快速測定方法研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2012（19）： 294-296，300.