趙 晶 張愛(ài)琳 何新益 范建濤

(1.天津市寧河縣產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，天津 301500;2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384)

近年來(lái)，全球食物過(guò)敏的發(fā)生率已呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)嚴(yán)重地影響了部分人群的生活質(zhì)量甚至危及生命，引起了各國(guó)尤其是發(fā)達(dá)國(guó)家的高度關(guān)注［1］。全球過(guò)敏癥受累人群超過(guò)25%，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，成年人食物過(guò)敏癥發(fā)生率超過(guò)1%;而嬰幼兒和兒童發(fā)生率達(dá)到了5% ～10%［2］;在中國(guó)，北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科對(duì)就診患者的調(diào)查顯示，每年約有1.5萬(wàn)患者為食物過(guò)敏［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)［4］，170多種食物能夠引起過(guò)敏反應(yīng)，其中，90%以上過(guò)敏反應(yīng)是由八大類高致敏性食物引起，包括牛乳、蛋類、花生、大豆、小麥、堅(jiān)果、魚和水生貝殼類動(dòng)物。為了防止消費(fèi)者誤食過(guò)敏性食物，美國(guó)、日本和歐盟都頒布了食物標(biāo)簽法，要求對(duì)食品中的8大類食物過(guò)敏原進(jìn)行標(biāo)注［5］。華南理工大學(xué)、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、江南大學(xué)、中國(guó)海洋大學(xué)、集美大學(xué)、南昌大學(xué)［6－10］等關(guān)于大米、蝦、牛奶、花生等的過(guò)敏源檢測(cè)及脫敏技術(shù)研究已見(jiàn)報(bào)道，但對(duì)堅(jiān)果過(guò)敏原的脫敏方法還未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)SDS—PAGE電泳技術(shù)及Western-blotting免疫印跡技術(shù)分析堅(jiān)果蛋白的大致分子量及致敏性;采用高溫、高壓、超聲波—微波協(xié)同萃取技術(shù)等物理手段和蛋白酶處理堅(jiān)果過(guò)敏蛋白，通過(guò)雙夾心抗體ELISA酶聯(lián)免疫試驗(yàn)方法檢測(cè)堅(jiān)果過(guò)敏蛋白的致敏效價(jià)，探索降低或脫除堅(jiān)果過(guò)敏蛋白的最佳方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

堅(jiān)果過(guò)敏陽(yáng)性血清:從致敏模型陽(yáng)性試驗(yàn)小鼠采集，免疫IgE濃度為100g/L;

核桃:產(chǎn)自天津薊縣;

黑芝麻:產(chǎn)自遼寧省丹東市;

開(kāi)心果:產(chǎn)自蔚縣黃梅鄉(xiāng);

腰果:產(chǎn)自伊朗;

HRP標(biāo)記山羊抗人IgE抗體(進(jìn)口):艾美捷科技有限公司;

堅(jiān)果過(guò)敏病人陽(yáng)性血清(7人混合):天津市總醫(yī)院;

鄰苯二胺:分析純，天津大學(xué)科威公司;

牛血清白蛋白:標(biāo)準(zhǔn)品，北京智杰方運(yùn)有限公司;

胰蛋白酶:比活力＞2500NFU/mg，上海鶴善實(shí)業(yè)有限公司;

胃蛋白酶:比活力3800NFU/mg，上海雅心生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

電泳系統(tǒng):Mini-PROTEAN型，美國(guó)BIO-rad公司;

微波超聲波聯(lián)合萃取儀:CW-2000型，江蘇榮華儀器有限公司;

凝膠成像系統(tǒng):GL2200PRO型，美國(guó)Kodach公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的粗提取

(1)粉碎:各類堅(jiān)果去殼及膜質(zhì)內(nèi)種皮后，置于(30±1)℃烘箱中干燥48h，烘干后的堅(jiān)果于冰浴中研磨成分，過(guò)40目篩，備用。

(2)去脂:堅(jiān)果粉與石油醚以1︰10(m︰V)的比例充分混合后置于4℃，每隔1h攪拌1次，6～8h后更換石油醚，重復(fù)3～4次后，直到堅(jiān)果粉呈白色為止，于4℃下放置，直至石油醚揮發(fā)完全。

(3)堅(jiān)果蛋白的提取:稱取脫脂后的堅(jiān)果粉與 Tris—HCl緩沖液(TBS，0.2mol/L、pH7.4)以 1 ︰10(m︰V)的比例充分混合均勻，然后于4℃浸提24h，期間每隔1～2h攪拌一次，之后在4℃、5000r/min離心15min，最后收集的上清液為堅(jiān)果蛋白的Tris—HCl提取液。

(4)堅(jiān)果蛋白提取物的硫酸銨分級(jí)沉淀:首先通過(guò)飽和度差值為20%的硫酸銨進(jìn)行分段沉淀。硫酸銨研磨成粉末，4℃冷卻備用。量取50mL蛋白粗提液在離心管中，先加入硫酸銨使硫酸銨飽和度為40%，充分溶解后4℃靜置1h，之后在5000r/min、4℃離心30min，然后棄去沉淀，收集上清液備用;上清液中再加入適量硫酸銨粉末，使硫酸銨飽和度達(dá)80%，同上操作，得沉淀。

(5)透析:沉淀分別用少量 TBS(0.01mol/L、pH8.0)溶解，置于透析袋(截留分子量8kDa)中，用相同的 TBS4℃透析，BaCl2檢測(cè)至無(wú)硫酸銨為止。透析液置于冷凍干燥機(jī)中凍干即為堅(jiān)果蛋白粗提物，4℃貯藏備用。

1.3.2 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照文獻(xiàn)［6］。

1.3.3 蛋白質(zhì)的處理方法

(1)高溫高壓處理:取濃度約為1.0mg/mL的4種堅(jiān)果蛋白各2mL，置于壓力為102.9kPa，溫度為121℃的高壓鍋內(nèi)處理20min，處理時(shí)管塞切勿塞得過(guò)緊，以免蛋白溶液噴射出來(lái)。處理后于冰箱內(nèi)冷凍保存。

(2)微波—超聲波聯(lián)合處理:根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別取4種堅(jiān)果蛋白溶液在CW-2000微波超聲聯(lián)合萃取儀進(jìn)行如表1的正交處理。由于蛋白樣品有限，處理時(shí)選取100mL的玻璃瓶，清洗時(shí)勿使底部鐵塊沾到水。處理后的蛋白冷凍保存。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 Thedesignoforthogonalexperiment

(3)酶處理:分別取經(jīng)高溫高壓和微波超聲聯(lián)合處理后的蛋白溶液各1mL，于37℃ pH7.8的條件下用活力單位為2000U，稀釋濃度為0.25%胰蛋白酶處理5min，pH2.0的條件下用活力單位為2800U，稀釋濃度為0.7μg/mL胃蛋白酶處理5min，處理后冷凍保存。

1.3.4 免疫印跡方法鑒定過(guò)敏原

(1)SDS—PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳配置方案:凝膠配置比例見(jiàn)表2。

(2)轉(zhuǎn)膜:① 膠的處理:膠切成適當(dāng)大小，放于負(fù)極緩沖液中平衡15min;②膜的處理:膜PVDF切成與膠相同大小，在甲醇中浸泡15s再放于bufferⅡ中至少5min;③貼膜順序:按照陽(yáng)極、兩層濾紙(于bufferⅠ中浸泡)、1層濾紙(于buffer中浸泡)、PVDF膜、膠、3層濾紙(浸泡于負(fù)極緩沖液)、負(fù)極的順序疊加;④轉(zhuǎn)膜完畢后，用TBST+5%的脫脂奶粉于4℃封閉過(guò)夜。

表2 凝膠配置比例Table2 TheratioofGelallocation mL

(3)免疫反應(yīng):①將封閉過(guò)夜的PVDF膜用PBS清洗5次，每次10min。洗完后用 TBST洗膜5次，每次10min;②將膜置于過(guò)敏者血清中，按照1︰2000的比例用TBST稀釋，于37℃溫育1h，然后棄一抗，用TBST洗膜5次，每次10min;③ 洗膜后，將膜置于1︰5000稀釋的二抗中溫育1 h，震蕩。然后用TBST洗膜5次，每次10min;④ ECL顯色:穩(wěn)定劑與增強(qiáng)型發(fā)光劑按1︰1混合，均勻滴到膜上，顯色1 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖形分析 用Excel2003統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算誤差并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用考馬斯亮藍(lán)法配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白后測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線見(jiàn)圖1。

由圖1可知，蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.5338x+0.0144，R2=0.9974，方程呈線性相關(guān)。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1 ThestandardcurvesofBCA

2.2 蛋白得率測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定各堅(jiān)果蛋白含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出蛋白得率(樣品平行測(cè)定3組，取平均值)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白得率Figure2 Proteinyieldofthenuts

由圖2可知，蛋白質(zhì)得率效果最高的是開(kāi)心果樣品，提取得率最低的是核桃樣品，蛋白得率為42.1%，綜合各堅(jiān)果的特性，本提取方法對(duì)4種堅(jiān)果樣品均有較好的提取效果。

2.3 超聲波—微波正交處理結(jié)果

選取腰果蛋白進(jìn)行超聲波—微波聯(lián)合處理正交試驗(yàn)，并測(cè)定處理后的蛋白含量，見(jiàn)表3。

表3 腰果蛋白超聲波—微波正交處理結(jié)果Table3 TheorthogonalprocessingresultsofultrasonicmicrowaveonCashewprotein

由表3可知:各試驗(yàn)因素主次順序?yàn)?B＞C＞A，最優(yōu)工藝組合為B3C1A2，即240s、90℃、700W。同時(shí)，通過(guò)對(duì)各影響因素與空列組R值的比較，發(fā)現(xiàn)B，C兩因素的R值低于空列組，說(shuō)明微波處理中選擇合適的溫度和功率對(duì)脫敏效果有較大的影響，而因素A的R值高于空列組，說(shuō)明微波處理的時(shí)間對(duì)脫敏效果影響不明顯。對(duì)脫敏效果有影響的其他因素如壓力、超聲波頻率或樣品的破碎程度等還沒(méi)有進(jìn)行分析，對(duì)此，課題組還將在后期進(jìn)一步增加正交試驗(yàn)的影響因素，并結(jié)合免疫印跡及SDS—PAGE電泳加以分析驗(yàn)證。

2.4 堅(jiān)果過(guò)敏蛋白分離純化SDS—PAGE電泳分析和蛋白粗提液免疫印跡結(jié)果

取3種堅(jiān)果蛋白分別用上樣緩沖液稀釋到1mg/mL后上樣，進(jìn)行電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4。采用對(duì)堅(jiān)果類食品過(guò)敏者陽(yáng)性混合血清為一抗，HRP標(biāo)記山羊抗人IgE抗體為二抗，ECL顯色法進(jìn)行顯色對(duì)3種堅(jiān)果蛋白的過(guò)敏原進(jìn)行了免疫印跡分析，在暗室中根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間以得到最佳結(jié)果，見(jiàn)圖3。

由圖3可知，各堅(jiān)果樣品都含有多種蛋白成分。最富集的各樣品條帶分別為腰果23kU和13kU、杏仁15kU和25 kU、核桃13kU和24kU。由免疫印跡圖可以看出，每種堅(jiān)果蛋白都能使陽(yáng)性血清產(chǎn)生致敏性，腰果有兩個(gè)過(guò)敏條帶，在32kU和42kU附近，42kU附近的條帶為主要過(guò)敏原。核桃只有一個(gè)過(guò)敏條帶，在35kU附近。杏仁也只有一個(gè)過(guò)敏條帶，在42kU附近。

2.5 物理法結(jié)合酶法處理后蛋白的免疫印跡結(jié)果對(duì)比分析

由圖4可知，堅(jiān)果的過(guò)敏原主要是分子量在0.7～100kU的高度糖基化蛋白質(zhì)，它們分別屬于不同的蛋白質(zhì)家族。其中Arah1、Arah2和Arah3是主要的致敏蛋白，90%的病人血清都能識(shí)別他們。Arah1具有熱穩(wěn)定性強(qiáng)、耐酶解、不易消化等特性。超聲波—微波聯(lián)合處理能使這些肽鍵的作用力弱化，空間構(gòu)象發(fā)生改變，致敏抗原性降低。高溫高壓與酶法聯(lián)合處理，該方法幾乎能完全脫除堅(jiān)果類過(guò)敏原蛋白的致敏性，但對(duì)腰果的致敏蛋白脫除效果不徹底。蛋白酶可通過(guò)引起Arahl和Arah2的聚合反應(yīng)來(lái)降低堅(jiān)果蛋白的致敏性。由于堅(jiān)果過(guò)敏蛋白Arah1、Arah2、Arah3中抗原決定簇多含有絲氨酸，而蛋白酶能使絲氨酸連鍵斷裂，使其抗原性降低。

圖3 腰果、杏仁、核桃粗提液蛋白SDS—PAGE結(jié)果堅(jiān)果提取過(guò)敏原蛋白免疫印跡結(jié)果Figure3 ResultofSDS—PAGEtestwestern-blottingtest andontheproteinofnuts

圖4 物理法及結(jié)合酶法處理對(duì)堅(jiān)果過(guò)敏性的影響Figure4 Theeffectonthetreatmentofphysicalmethod andcombinedwithenzymeaboutnutallergic

3 結(jié)論

(1)本研究結(jié)果表明超聲波－微波協(xié)同處理結(jié)合特殊蛋白酶能夠使堅(jiān)果過(guò)敏蛋白變性失活，在作用溫度為90℃、處理時(shí)間240s、微波功率700W結(jié)合0.25%胰蛋白酶處理5min能使其致敏性幾乎完全脫除，是脫除堅(jiān)果過(guò)敏原的有效方法。

(2)超聲波—微波結(jié)合蛋白酶處理能夠脫除堅(jiān)果過(guò)敏原，使結(jié)合肽鍵的作用力弱化，空間構(gòu)象發(fā)生改變，致敏抗原性降低，比熱力脫除過(guò)敏原效果更好，更加節(jié)約成本。

(3)本研究的不足之處是沒(méi)有對(duì)失去致敏活性的蛋白結(jié)構(gòu)及營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，后期需要繼續(xù)研究。

1 Merima Bublin，Heimo Breiteneder．Cross-reactivity of peanut aller-gens［J］．Current Allergy and Asthma Reports，2014，14(1):426 ～453．

2 張愛(ài)琳，王昌祿，胡云峰，等.堅(jiān)果類過(guò)敏原的分離及免疫印跡分析［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30(3):99～102.

3 李生平.銀杏種子萌發(fā)過(guò)程中貯藏物質(zhì)代謝機(jī)理的研究［D］.南京:南京林業(yè)大學(xué)，2004.

4 向錢，李寧.食品致敏性研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2006，33(6):376 ～380.

5 Joseph P，Strain G，Ebel F．Application regarding ginkgo biloba［J］．Journal of the American Dietetic Association，2007，107(9):1 492 ～1492．

7 李欣，高金燕，陳紅兵.水牛奶中β-乳球蛋白過(guò)敏原表位定位的初步研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(10):360～363.

8 杜若源，謝晶，王婷，等.超聲波輔助提取銀杏葉總黃酮的工藝優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2015，31(1):167 ～170

9 De Luis Ruth，Mata Luis，Estopanan Gloria．Evaluation of indirect competitive and double antibody sandwich ELISA tests to determine-lactoglobulin and ovomucoid in model processed foods［J］．Food and Agricultural Immunlilgy，2008(19):339 ～350．

10 Hamid Reza Nouri，Danial Afsharzadeh，Abdolreza Varasteh．Diag-nosis of Chenopodium album allergy with a cocktail of recombinant allergens as a tool for component-resolved diagnosis［J］．Mol Biol Rep，2012(39):3 169～3 178．