譚 萱 王嘉康 韓 維 張惠華 管文華 張 航 麥迪思 陳小佳＊

（1基因工程藥物國家工程研究中心，廣東省生物工程藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院細(xì)胞生物學(xué)系，廣州510632；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州510095）

我國是食道癌的高發(fā)地區(qū)，每年因食道癌死亡者約15萬人，占全部惡性腫瘤死亡近四分之一。食管癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，一旦診斷出，一半以上的病人由于晚期而無法手術(shù)切除 ，即使采取切除手術(shù)，也只有不到1／4的病人可以有五年以上的存活率［1－3］，因此食管癌的防治非常重要。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma－associated fibroblasts，CAF）是腫瘤微環(huán)境中最主要的間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)腫瘤的發(fā)展和惡化有促進(jìn)作用，也使CAFs成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)［4］。目前關(guān)于食管癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的分離和鑒定沒有快速有效的方法，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室也憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行分離沒有相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的程序。因此本文參考其他腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法［5－8］，就食管癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法進(jìn)行探索，建立了快速分離較純的成纖維細(xì)胞的方法，也分離癌旁正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs），并且對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特性進(jìn)行了初步的評(píng)價(jià)和鑒定，比較CAFs和NFs的生長(zhǎng)特性并檢測(cè)基因FGFR2在CAFs和NFs中表達(dá)差異，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材料

1.1 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM（美國Gibco），胎牛血清（以色列Bioind），（Cell Counting Kit（CCK8））（日本同仁化學(xué)）fibronectin、Cytokeratin抗體（美國Dako）

1.2 組織來源 取新鮮食管癌腫瘤組織，在距離癌區(qū)域≥3cm取正常組織。0－4℃保存，2h內(nèi)處理。

2.方法

2.1 組織處理在0－4℃的PBS中浸泡20min。

2.2 組織塊法

將組織塊剪碎為1mm3，15－20塊小的組織塊放入6cm培養(yǎng)皿中，加20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、培養(yǎng)每4－5d更換培養(yǎng)基，直到細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿。

2.3 酶消化法

將組織塊剪至≤1mm3加入含0.02%EDTA的胰蛋白酶1.5ml，37℃消化8min，終止消化；取上清離心1000rpm 5min，棄上清用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻沉淀，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

2.4 酶消化法和組織塊法結(jié)合培養(yǎng)

前期處理和酶消化法一致，消化離心后將組織塊和細(xì)胞沉淀一起收集，用含20%FBS的DMEM吹打混勻，將組織塊和細(xì)胞沉淀一起置于7cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

2.5 細(xì)胞的純化

與上皮細(xì)胞相比，成纖維細(xì)胞更易貼壁，將細(xì)胞懸液加到6孔板第一個(gè)孔中，靜置20min，貼壁的細(xì)胞幾乎均為成纖維細(xì)胞。其上清吸至第二個(gè)孔中靜置20min，吸棄上清，兩孔貼壁的細(xì)胞用含10%FBS的DMEM吹打混勻，37℃、5%CO2、培養(yǎng)，直至長(zhǎng)滿。

2.6 細(xì)胞傳代

細(xì)胞長(zhǎng)80%－90%后，胰酶溶液消化，用含10%FBS的DMEM吹打混勻并傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

2.7 間接免疫熒光檢測(cè)

常規(guī)方法細(xì)胞爬片處理后，4%多聚甲醛常溫固定20min，0.1%Triton X－100 4℃ 穿透處理10min，4%BSA的PBS溶液于37℃封閉30min，孵fibronectin、Cytokeratin的抗體溶液，4℃過夜，陰性對(duì)照用PBS。第二天，PBST洗3次，孵二抗（避光）溶液37℃40min，PBST洗三次，加DAPI，室溫10min，PBST洗三次。在每孔中加入少量的PBST（可避免熒光快速淬滅），熒光顯微鏡檢測(cè)。

2.8 細(xì)胞增殖的測(cè)定

待CAFs／NFs細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按照日本同仁化學(xué)公司的Cell Counting Kit（CCK8）說明書操作，測(cè)得細(xì)胞OD值繪制生長(zhǎng)曲線。

2.9 細(xì)胞周期檢測(cè)

分別收集NFs和CAFs（1×106個(gè)），加入預(yù)冷預(yù)冷70% 乙醇，4℃固定1h；RNaseA（終濃度0.25mg／ml）37℃ 消化30min；細(xì)胞染色：加入碘化丙錠（PI），室溫避光染色30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.10 實(shí)時(shí)定量 RT－PCR

按照Takara公司SYBR說明書加樣，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；變性95℃15s，退火60℃15s、延伸72℃15s，72℃10min重復(fù)40個(gè)循環(huán)，軟件分析獲得Ct值，并根據(jù)熔解曲線判斷產(chǎn)物的純度。

2.11 蛋白免疫印跡 Western blot

分別收集CAFs和NFs細(xì)胞，用用預(yù)冷的RIPA裂解液裂解后取上清，BCA細(xì)胞定量，12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉室溫2h，孵一抗1∶2500稀釋的FGFR2抗體、1∶10000稀釋的β－actin抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后，1∶3000稀釋的二抗孵育室溫1h，TBST洗膜后曝光。

結(jié) 果

1.人食管癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞及癌旁成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)和純化

1.1 三種方法均可獲得原代成纖維細(xì)胞

如圖（1），組織塊法獲得成纖維細(xì)胞，最早7d左右有細(xì)胞在組織外游離出來，但此時(shí)細(xì)胞少有明顯的纖維狀，而是混雜著不規(guī)則的形態(tài)，10d左右可見較多的放射狀的細(xì)胞。25d左右細(xì)胞可以70%－80%融合。

消化法獲得的成纖維細(xì)胞，最早3d左右可見成纖維狀細(xì)胞貼壁，獲得細(xì)胞較少，混雜其他形態(tài)的細(xì)胞相對(duì)較少，20d左右細(xì)胞能70%－80%融合。

組織塊和消化法結(jié)合培養(yǎng)法獲得的成纖維細(xì)胞一般3d左右可見成纖維狀細(xì)胞不同區(qū)域分布，且組織塊外細(xì)胞開始有細(xì)胞游離出來混雜其他形態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)很快，12d左右可以70%－80%融合。

圖1 三種方法均成功分離出原代細(xì)胞CAFs、NFs。Fig.1Three methods successfully isolated the primary cell CAFs、NFs。

1.2 細(xì)胞傳代和純化

培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞首次傳代消化所需要的時(shí)間稍長(zhǎng)一些，癌旁正常組織長(zhǎng)出的成纖維細(xì)胞即NFs一般傳代可到8代左右，而CAFs可以傳代到11代左右。初次獲得的第一代細(xì)胞形態(tài)混雜，有不規(guī)則的上皮樣細(xì)胞以及成纖維樣細(xì)胞，經(jīng)差時(shí)貼壁法初步純化以及自然純化后第三代的細(xì)胞就幾乎不見上皮樣細(xì)胞。

2.食管癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的鑒定

2.1 顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)觀察

在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)大多呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核呈卵圓形，細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)呈現(xiàn)放射狀或渦旋狀，可覆蓋生長(zhǎng)。NFs和CAFs形態(tài)上存在差異，NFs細(xì)胞相對(duì)較小些，細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，CAFs放射狀排列，細(xì)胞形態(tài)為梭形或星形。

2.2 細(xì)胞間接免疫熒光結(jié)果

CAFs和NFs中成纖維細(xì)胞marker：fibronectin陽性表達(dá)，上皮細(xì)胞marker：Cytokeratin陰性表達(dá)（圖2）。陽性對(duì)照分別選擇成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞及上皮來源的食管癌細(xì)胞KYSE30。

圖2 細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明分離獲得的細(xì)胞均為成纖維細(xì)胞。×200Fig.2Indirect immunocytochemical assay results indicate that the isolated cells are all fibroblasts.×200

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)根據(jù)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞生長(zhǎng)的整體趨勢(shì)呈現(xiàn)為S形，前兩天細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢處于遲緩期，2－4d細(xì)胞生長(zhǎng)迅速處于對(duì)數(shù)期，第5－6d開始細(xì)胞生長(zhǎng)開始緩慢即細(xì)胞處于穩(wěn)定期，根據(jù)CAFs和NFs的生長(zhǎng)曲線可見CAFs細(xì)胞生長(zhǎng)較NFs相比生長(zhǎng)迅速（圖3A）。

2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

流式檢測(cè)CAFs和NFs，分析細(xì)胞各時(shí)期的含量結(jié)果顯示如圖（3B）：CAFs與NFs相比，CAFs細(xì)胞的S期、G2M期增多，即細(xì)胞增殖快。該結(jié)果與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果一致。

圖3 A.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CAFs細(xì)胞增殖比NFs要快。B.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示：CAFs與NFs相比，S、G2M期均增加。C.細(xì)胞周期檢測(cè)統(tǒng)計(jì)分析。Fig.3A.cell proliferation experiment shows that CAFs are faster than NFs in cell rate.B.flow cytometry histogram shows that the percentages of cells in S and G2－M phases were significantly higher in TFs compared with NFs.C.statistic analysis of cell phases

圖4 CAFs和NFs中FGFR2的mRNA和蛋白水平的檢測(cè)。A.QPCR檢測(cè)，B.western blot檢測(cè)Fig.4The expression levels of FGFR2mRNA and protein were determined in the CAFs、NFs cells.A.QPCR detection；B.western blot detection

3.食管癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的FGFR2高表達(dá)的鑒定

3.1 實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測(cè)FGFR2在CAFs和NFs基因水平中表達(dá)差異，結(jié)果如圖（4，A）表明，在CAFs中FGFR2mRNA表達(dá)量明顯比NFs高。

3.2 蛋白免疫印跡 Western blot檢測(cè)FGFR2在CAFs和NFs蛋白水平的表達(dá)差異，如圖（4，B）表明和定量檢測(cè)結(jié)果一致，即CAFs中FGFR2蛋白表達(dá)比NFs高。

討 論

細(xì)胞的原代培養(yǎng)一直存在較大難度，為了獲得原代細(xì)胞必須克服污染問題，食管是一個(gè)開放性器官，其腫瘤組織易受細(xì)菌、霉菌的污染，所以較難培養(yǎng)［9］。本實(shí)驗(yàn)處理了30對(duì)標(biāo)本，成功獲得的細(xì)胞有24對(duì)，經(jīng)鑒定已經(jīng)明確獲得的細(xì)胞均為成纖維細(xì)胞。早期進(jìn)行方法的摸索之后，中后期的成功率達(dá)到100%，說明我們建立的方法是可行的，經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下：

首先，從手術(shù)室無菌條件下取標(biāo)本后立即放入無菌離心管中，冰上拿回實(shí)驗(yàn)室2h內(nèi)處理標(biāo)本。第二，處理標(biāo)本時(shí)一定要用含雙抗的PBS或者Hanks沖洗幾遍，并去除組織塊外面的血塊及脂肪類組織，處理中組織塊處于溶液狀態(tài)中。第三，有組織塊時(shí)，培養(yǎng)基不能太多，一般剛好使組織塊可以半懸浮即可。除了加雙抗外，初期一般用20%FBS的DMEM，等細(xì)胞傳代后即可換回10%FBS的DMEM。最后，關(guān)于細(xì)胞的純化，本實(shí)驗(yàn)采取的是差速貼壁法和自然純化法的結(jié)合，最后第三代獲得較純的成纖維細(xì)胞，盡管有實(shí)驗(yàn)室是根據(jù)梯度離心和流式分選［10，11］，但操作麻煩，費(fèi)時(shí)，處理的時(shí)間的增長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞污染的可能性增加。

通過本研究建立的方法，能順利獲得食管癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，為進(jìn)一步研究食管癌腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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