趙春艷 管英俊 陳燕春 高海玲

（濰坊醫(yī)學院組織胚胎學教研室，山東261053）

神經管畸形是由于正常的神經發(fā)育受到干擾所導致的神經管結構異常，形成腦、脊髓等中軸部位的畸形，常常是環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的結果［1］。由于神經管畸形發(fā)病率高且后果嚴重，其預防和治療已成為該研究領域的熱點。有報道證實環(huán)磷酰胺具有明顯的胚胎毒性和致畸作用，神經管畸形尤為常見［2，3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可以通過抑制神經上皮細胞的增殖、遷移、分化導致神經管畸形［4－6］，但其分子機制尚不明確。經典的Wnt／β－catenin通路失調與神經管畸形密切相關［7］。本實驗在已證實的環(huán)磷酰胺致大鼠神經管畸形［3］的基礎上，應用免疫熒光技術檢測Wnt經典通路的起始信號分子Wnt－1及其受體Fzd－1的表達變化，以探討神經管畸形發(fā)生的分子機制，為神經管畸形的防治提供實驗依據。

材料和方法

1.實驗動物

10周齡成年未經產雌性SD大鼠，體重均為220－250g，購自山東中醫(yī)藥大學動物中心。

2.主要藥品與試劑

環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；兔抗Wnt－1，CST公司；兔抗Fzd－1，Santa Cruz公司；Cy3標記的羊抗兔IgG，Sigma公司。

3.建模與制備切片

SD大鼠于8：00PM按雌雄2：1合籠，翌日8：00AM進行陰道涂片檢查，查見精子者則記為妊娠第0d（E0d）。將所得的40只孕鼠隨機分成實驗組和對照組，每組20只。E13d8：00AM，實驗組按15mg／kg體重向腹腔內注射環(huán)磷酰胺，對照組注射等劑量生理鹽水。按照注射后的時長將實驗組和對照組的孕鼠均隨機分為4個組：8、12、24、48h。以斷頸方式處死孕鼠，取胎鼠，同一窩別的胚胎隨機選取3只，每個時間點可得15只胎鼠，經中性福爾馬林固定后進行石蠟包埋，制備連續(xù)切片，厚度為5μm。

4.免疫熒光染色

切片常規(guī)脫蠟至水；0.01mol／L檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進行微波抗原修復，PBS沖洗；羊血清封閉；甩去血清，分別滴加兔抗 Wnt－1（1：100）、兔抗Fzd－1（1：50），4℃孵育過夜；PBS沖洗；滴加 Cy3標記的羊抗兔IgG（1：400），避光37℃孵育50min；PBS沖洗；滴加 Hochest33258（1：1000），避光37℃孵育20min；PBS沖洗；抗熒光淬滅封片液封片；鏡下拍攝照片。

5.統(tǒng)計學分析

使用IPP5.1圖像分析軟件分析 Wnt－1、Fzd－1的累積光密度值（IOD）。所得數據均以表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對組間數據進行t檢驗比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.Wnt－1在神經上皮中的表達變化

注射后8h，對照組Wnt－1陽性細胞數量少，僅見于背側和背外側的邊緣處，腹側表達較弱；實驗組與對照組相比，陽性細胞的分布及數量均無顯著差異；注射后12h，對照組中神經管背外側的 Wnt－1陽性細胞增多，表達范圍增大、強度升高；實驗組與對照組相比 Wnt－1陽性細胞的分布和累積光密度值未見明顯變化。注射后24h，隨著神經管頂板、翼板、底板、基板的出現(xiàn)，對照組 Wnt－1陽性細胞數量明顯增多，分布范圍從背側向腹側擴展，遍及神經管套層的各個部分，表達強度亦顯著增強；與對照組比較，實驗組 Wnt－1陽性細胞極少，僅分布于頂板邊緣和翼板外側份，腹側底板和基板表達甚弱或不表達，累積光密度值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。注射后48h，對照組 Wnt－1陽性細胞減少，分布于頂板、翼板和基板的外側份，神經管腹側中央管周圍陽性表達降低；與對照組比較，實驗組陽性細胞極少，僅分布于頂板邊緣，累積光密度值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1，3）。

圖3 環(huán)磷酰胺致大鼠NTDs神經上皮細胞中 Wnt－1陽性細胞IOD分析，＊P＜0.05vs對照組Fig.3Integrated Optical Density analysis of Wnt－1positive cells in the neuroepithelial cells of NTDs in rats induced by cyclophosphamide.＊P＜0.05 vs the control group

圖4 環(huán)磷酰胺致大鼠NTDs神經上皮細胞中Fzd－1陽性細胞IOD分析，＊P＜0.05 vs對照組Fig.4Integrated Optical Density analysis of Fzd－1positive cells in the neuroepithelial cells of NTDs in rats induced by cyclophosphamide.＊P＜0.05vs the control group

2.Fzd－1在神經上皮中的表達變化

Fzd－1在神經管上皮中的表達變化與 Wnt－1的表達變化一致。注射后8h，對照組Fzd－1陽性細胞少，僅散在于神經管背側和背外側；實驗組陽性表達弱，與對照組比較無顯著差異。注射后12h，對照組背外側Fzd－1陽性細胞增多，表達強度升高；實驗組陽性細胞分布與對照組一致，累積光密度值未見明顯改變。注射后24h，神經管各部分結構逐漸形成，對照組Fzd－1陽性細胞顯著增多，頂板、翼板、底板、基板均呈強陽性表達；實驗組Fzd－1陽性表達極低，陽性細胞僅散在于背側近邊緣處，其余部位未見表達，與對照組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。注射后48h，對照組陽性表達降低，陽性細胞分布于神經管頂板、翼板外側，而翼板內側、基板中央部位及底板處均未見表達；實驗組陽性細胞較對照組明顯減少，僅在背外側邊緣有少量陽性表達，其余部位均呈陰性，與對照組相比，實驗組陽性細胞累積光密度值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2，4）。

圖1 Wnt－1在環(huán)磷酰胺致大鼠神經管畸形神經上皮細胞中的表達（×200）。對照組（A，C，E，G）、實驗組（B，D，F(xiàn)，H）；8h（A，B）、12h（C，D）、24h（E，F(xiàn)）、48h（G，H）。Fig.1The expression of Wnt－1in the neuroepithelial cells of NTDs in rats induced by cyclophosphamide（×200）.control group（A，C，E，G），experimental groups（B，D，F(xiàn)，H），at 8h（A，B），at 12h（C，D），at 24h（E，F(xiàn)），at 48h（G，H）.圖2 Fzd－1在環(huán)磷酰胺致大鼠神經管畸形神經上皮細胞中的表達（×200）。對照組（A，C，E，G）、實驗組（B，D，F(xiàn)，H）；8 h（A，B）、12h（C，D）、24h（E，F(xiàn)）、48h（G，H）。Fig.2The expression of Fzd－1in the neuroepithelial cells of NTDs in rats induced by cyclophosphamide（×200）.control group（A，C，E，G），experimental groups（B，D，F(xiàn)，H），at 8h（A，B），at 12h（C，D），at 24h（E，F(xiàn)），at 48h（G，H）.

討 論

神經管的形成發(fā)育是細胞發(fā)生有序地增殖、分化、遷移、粘著、凋亡的結果，受到多種信號通路構成的復雜網絡調控。Wnt信號通路在調節(jié)胚胎各部分發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［8］，與神經發(fā)生及神經系統(tǒng)疾病有關，是所有物種神經發(fā)育各個階段必不可少的信號分子。

Wnt－1是一個發(fā)育相關基因，通過激活 Wnt／βcatenin經典通路參與胚胎多部位、多組織的發(fā)育。有文獻報道小鼠胚胎發(fā)育時，Wnt－1主要分布在發(fā)育中的中樞神經系統(tǒng)，在脊髓的頂板，間腦的背側，中腦、后腦及其交界區(qū)域均有特異的表達［9］。卷曲蛋白Frizzled（Fzd）是Wnt蛋白的受體，二者結合后可以激活細胞內信號通路，調節(jié)靶基因的表達。目前，Wnt－1和Fzd－1在環(huán)磷酰胺引起的大鼠神經管畸形中的作用尚未報道。

研究結果顯示：對照組 Wnt－1、Fzd－1的累積光密度值先升高后降低，處理后24h表達最強；分布范圍先擴大后縮小，從背側頂板擴大到兩側翼板再到腹側的基板和底板，處理后24h分布最廣，處理后48h又縮小至頂板、翼板和基板的外側份。前期實驗發(fā)現(xiàn)對照組中處理后24h增殖細胞數量最多，而處理后48h增殖細胞數量驟減、細胞分化明顯［4］，增殖細胞數量的變化趨勢與 Wnt－1、Fzd－1的表達變化規(guī)律一致。說明在神經管發(fā)育過程中，背側細胞首先分泌 Wnt－1蛋白并以自分泌或旁分泌作用與跨膜受體Fzd－1結合促使細胞增殖，隨著神經上皮細胞向外周的遷移，Wnt－1、Fzd－1陽性細胞數量逐漸增多、表達范圍逐步向腹側擴大，處理后24h達到高峰，此后 Wnt－1、Fzd－1信號逐漸減弱，細胞逐步分化。在對動物脊髓發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt－l具有有絲分裂原活性，Wnt信號強的部位細胞表現(xiàn)為大量增殖，Wnt信號弱的部位細胞則表現(xiàn)為大量分化［1］。Fzd－1可以與 Wnt－1、Wnt－3、Wnt－3a結合激活 Wnt／β－catenin信號通路［10］，調節(jié)細胞周期。上述結果表明Wnt－1及其受體Fzd－1參與調控神經上皮細胞的增殖活動。

本研究實驗組與對照組相比，Wnt－1、Fzd－1均在用藥后24、48h表現(xiàn)為陽性表達范圍縮小、表達強度明顯降低，提示環(huán)磷酰胺抑制了大鼠神經上皮細胞中 Wnt－1及其受體Fzd－1的表達，干擾經典Wnt通路的傳導，影響神經上皮細胞的增殖能力。前期實驗結果顯示環(huán)磷酰胺可以抑制神經上皮細胞的增殖并增加細胞之間的粘附［4，6］，而細胞粘附能夠抑制細胞的有絲分裂原活性蛋白，使細胞增殖受到抑制，與本實驗結果吻合。有文獻報道小鼠Wnt－1基因不表達、過表達［11］或 Fzd－1基因突變［12］均能引起神經管閉合不全。本課題組的另一研究結果顯示非經典 Wnt信號通路的 Wnt5a、Fzd2也參與了環(huán)磷酰胺的致畸過程［13］。綜上所述，環(huán)磷酰胺可以干擾神經上皮細胞中Wnt信號通路的正常傳導，導致神經管畸形的發(fā)生。

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