李純佳，徐超華，陸鑫，覃偉，劉家勇

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開遠(yuǎn)661699）

甘蔗胚性愈傷高效誘導(dǎo)系列研究II.基礎(chǔ)培養(yǎng)基對甘蔗胚性愈傷發(fā)生的影響

李純佳，徐超華，陸鑫，覃偉，劉家勇*

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開遠(yuǎn)661699）

在前期工作基礎(chǔ)上，以甘蔗栽培品種ROC22、桂11、云蔗06-407為材料，研究了不同類型培養(yǎng)基、氮素銨硝比和碳源對甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)的影響。結(jié)果顯示，不同類型培養(yǎng)基對甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)差異顯著，MK培養(yǎng)基為最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基，而氮素銨硝比和碳源作用不明顯。研究結(jié)果從基礎(chǔ)培養(yǎng)基角度優(yōu)化了甘蔗胚性愈傷直接誘導(dǎo)體系。同時(shí)，由于MK為原創(chuàng)培養(yǎng)基，本研究可豐富植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇。

甘蔗；胚性愈傷；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；氮素銨硝比；碳源

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我國和世界最重要的糖料作物。蔗糖約占世界食糖總產(chǎn)量的70%～80%，而在我國達(dá)90%以上[1]。優(yōu)良甘蔗新品種的選育對于我國食糖產(chǎn)業(yè)的安全和發(fā)展具有重要意義[2]。作為有別于傳統(tǒng)雜交育種的新途徑，甘蔗分子育種技術(shù)正受到世界各國的廣泛重視[3]。目前，巴西[4]、美國[5]、澳大利亞[6]、南非[7]和我國[8]的甘蔗科研工作者均已成功使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制出為數(shù)眾多、各具特色的甘蔗新材料，部分已形成品種。

對于甘蔗而言，胚性愈傷誘導(dǎo)是所有分子育種操作的前提。外植體、生長調(diào)節(jié)劑、基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為影響植物胚性愈傷發(fā)生的重要因素[9]。在劍麻（Agave sisalana）[10]、苧麻（Boehmeria nivea）[11]、金線蓮（Anoectochilus formosanus）[12]、東北紅豆杉（Taxus cuspidata）[13]、西洋杜鵑（Rhododendron hybridum）[14]的組培研究中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基對外植體愈傷誘導(dǎo)和分化均產(chǎn)生了巨大影響。以上研究表明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基對胚性愈傷發(fā)生的影響在植物中是廣泛存在的，但具體作用效果隨外植體遺傳背景和基因型不同而存在差異。甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)研究中，對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的作用關(guān)注較少。作為第一個(gè)組培成功的禾本科植物，前人對甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)進(jìn)行了大量研究，但這些工作大多以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對植物激素組合進(jìn)行優(yōu)化[15]。然而，戴友銘等[16]發(fā)現(xiàn)，甘蔗嫩葉鞘外植體褐化狀況隨基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同而存在差異。這項(xiàng)工作提示了篩選最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基對甘蔗離體培養(yǎng)的重要作用，基礎(chǔ)培養(yǎng)基對甘蔗胚性愈傷發(fā)生的影響不應(yīng)忽視。

此前的研究中，我們以甘蔗栽培品種ROC22幼葉為外植體，使用Dicamba、DA-6、CNS等較新穎的植物生長調(diào)節(jié)劑，建立了無需繼代的甘蔗胚性愈傷直接誘導(dǎo)體系[17]。在此基礎(chǔ)上，我們以甘蔗栽培品種ROC22、桂11、云蔗06-407為材料，研究了不同類型培養(yǎng)基、氮源銨硝比和碳源對甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)的影響，以期從基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分的角度進(jìn)一步優(yōu)化甘蔗胚性愈傷直接誘導(dǎo)體系，從而提高新體系在甘蔗育苗和分子育種中的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

所用材料為甘蔗栽培品種ROC22、桂11、云蔗06-407的無性系，種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所第一科研基地。KM8P培養(yǎng)基有機(jī)組分使用過濾滅菌法，無機(jī)組分及其他培養(yǎng)基使用濕熱滅菌法。MK培養(yǎng)基為自主命名，由MS無機(jī)成分和KM8P有機(jī)成分組成。

KNO3和NH4NO3為MS培養(yǎng)基的無機(jī)氮源，其中鉀素含量20 mmol/L，氮素含量60 mmol/L。保證鉀素和氮素總量不變的前提下，對氮素銨硝比進(jìn)行調(diào)整，方法見表1。

外植體選取、接種、培養(yǎng)、胚性愈傷判斷、發(fā)生率計(jì)算等方法均與先前報(bào)道[17]一致。所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

表1 氮素銨硝比調(diào)整方案

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型對甘蔗胚性愈傷發(fā)生的影響

表2顯示了不同類型基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的甘蔗胚性愈傷發(fā)生情況?；A(chǔ)培養(yǎng)基、植物激素、甘蔗品種對胚性愈傷發(fā)生均有著巨大影響。不同材料間胚性愈傷發(fā)生率同樣具有極顯著差異，是為內(nèi)因，由材料基因型決定。同一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基和外植體，富含植物生長調(diào)節(jié)劑的R處理取得的胚性愈傷發(fā)生率可比C處理的對照組高出2倍以上，處理間差異達(dá)極顯著水平。基礎(chǔ)培養(yǎng)基同樣影響巨大，方差分析結(jié)果顯示，不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基造成的差異可達(dá)極顯著水平。同時(shí)，植物激素、甘蔗品種與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同組合間差異分別達(dá)到顯著和極顯著水平，說明甘蔗胚性愈傷發(fā)生過程中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基同兩者存在強(qiáng)烈的交互作用。以上結(jié)果提示，對于特定的甘蔗材料，摸索適宜的激素組合固然重要，篩選最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基與之搭配同樣是重要的工作，應(yīng)予重視。

總體而言，N6和1/2MS培養(yǎng)基表現(xiàn)較差，MS和MK8P培養(yǎng)基表現(xiàn)較好，但在所有材料和處理中，最高胚性愈傷發(fā)生率均出現(xiàn)在MK培養(yǎng)基上。這說明相對傳統(tǒng)常用培養(yǎng)基而言，MK培養(yǎng)基能夠更好地支持甘蔗胚性愈傷的發(fā)生，并且這種優(yōu)勢不因外植體基因型和植物激素組合而改變。

2.2 培養(yǎng)基無機(jī)氮銨硝比對甘蔗胚性愈傷發(fā)生的影響

表3中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基和材料基因型仍然是甘蔗胚性愈傷發(fā)生率差異的主要來源。培養(yǎng)基無機(jī)氮的不同銨硝比間無顯著性差異，說明其并非甘蔗胚性愈傷發(fā)生率差異的主要來源。這一結(jié)果可能與所選材料優(yōu)異的氮利用效能有關(guān)。

同樣，無機(jī)氮銨硝比同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、甘蔗品種間的組合間差異也不顯著，表明無機(jī)氮銨硝比與二者的作用是彼此獨(dú)立的。需要注意的是，MK和MS培養(yǎng)基具有相同的無機(jī)成分，兩者差別僅在于有機(jī)成分。因而，本試驗(yàn)中無機(jī)氮銨硝比與基礎(chǔ)培養(yǎng)基間的相互獨(dú)立，實(shí)際上是無機(jī)氮銨硝比與有機(jī)組分間的作用獨(dú)立。

2.3 培養(yǎng)基碳源對甘蔗胚性愈傷發(fā)生的影響

如表4所示，材料基因型間差異達(dá)到極顯著水平，而不同碳源類型和用量對甘蔗胚性愈傷發(fā)生均未產(chǎn)生顯著影響。同時(shí)，碳源類型、用量、材料基因型三者，其兩兩間交互作用不顯著，表明三者的效應(yīng)是彼此獨(dú)立的。

本試驗(yàn)中，碳源對甘蔗胚性愈傷發(fā)生影響不大。

表2 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上甘蔗胚性愈傷發(fā)生情況

表3 無機(jī)氮銨硝比對甘蔗胚性愈傷發(fā)生的影響

表4 碳源對甘蔗胚性愈傷發(fā)生的影響

3 結(jié)論與討論

基礎(chǔ)培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的根本基質(zhì)，為外植體提供水、礦物質(zhì)、氮源、碳源等最基本的支持，并為植物激素調(diào)節(jié)外植體細(xì)胞分化提供介質(zhì)[18]。甘蔗不同基因型的遺傳、生理、生態(tài)特性各異，其胚性愈傷發(fā)生過程對營養(yǎng)成分的需求也不盡相同。因此，甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇關(guān)系重大。本研究中，MK培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好。MK培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基和KM8P培養(yǎng)基復(fù)合而成，兼具前者高濃度的無機(jī)鹽[19]和后者豐富的有機(jī)質(zhì)[20]。相對于其他培養(yǎng)基，MK培養(yǎng)基能夠更大限度地滿足甘蔗胚性愈傷發(fā)生的各種營養(yǎng)需求，在適宜的植物激素組合作用下，甘蔗幼葉外植體的分化能力得以充分展示。因此，我們認(rèn)為，豐富而全面的營養(yǎng)成分，可能是MK優(yōu)于其他培養(yǎng)基的關(guān)鍵。

培養(yǎng)基中氮素為胚性愈傷發(fā)生所必需，不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基氮素含量與氮素結(jié)構(gòu)不同，而不同植物對氮素的要求也各異[21]。無機(jī)氮銨硝比水平可以影響植物組培中外植體分化和器官形成。一般認(rèn)為，硝態(tài)氮作用更溫和，效果更理想，因而降低銨硝比可以取得更好的效果。在較低銨硝比的培養(yǎng)基上，西洋杜鵑更易出芽[14]，雞冠花（Celosia cristata L.）也更易開花[22]。但對于甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)而言，不同的無機(jī)氮銨硝比間差異不顯著。這可能是由于所選甘蔗材料氮素利用效能優(yōu)異，對兩種形態(tài)的氮素都能予以充分利用的緣故。

碳源亦為重要的培養(yǎng)基因子。不同的碳源類型和用量均可對組培造成影響。甘薯（Ipomoea batatas L. Lam.）中，葡萄糖和蔗糖對愈傷生長的促進(jìn)作用大于果糖[23]。濃度為20～30 g/L的葡萄糖、果糖和蔗糖對白樺（Betula platyphylla Suk.）愈傷的增重效果優(yōu)于10～20 g/L和30～50 g/L[24]。然而，本研究中，碳源不同類型和用量對甘蔗胚性愈傷誘導(dǎo)的作用均未達(dá)顯著水平。這顯示了不同植物對培養(yǎng)基碳源需求的差異。

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Studies on High-efficiency Induction for Sugarcane Embryonic Callus II.Effects of Basal Medium to Sugarcane Embryonic Callus Induction

LI Chun-jia,XU Chao-hua,LU Xin,QIN Wei,LIU Jia-yong
(Yunnan Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences; Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement,Kaiyuan 661699)

Three sugarcane cultivars of ROC22,Gui 11 and Yunzhe 06-407 were tested to study the effects of variant basal mediums,ratio of ammonium to nitrate and carbon sources in sugarcane embryonic callus induction. The results showed that there were significant differences between different kinds of basal mediums,and MK medium was screened to be the optimum.However,there were no significant effects from different nitrogen forms and carbon sources.The results could offer an optimizing for previous inducting system of sugarcane embryonic callus from the aspect of basal medium,and the MK may broaden the choice of basal medium in plant tissue culturing.

sugarcane;embryonic callus;basal medium;ratio of ammonium to nitrate;carbon source

S566.1

A

1007-2624（2015）02-0001-03

10.13570/j.cnki.scc.2015.02.001

2015-02-16

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗品種改良與應(yīng)用省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2014HC015）；云南甘蔗雜交花穗規(guī)?；a(chǎn)與抗旱新品種選育及示范（2014RA059）；云南省技術(shù)創(chuàng)新人才培養(yǎng)對象（2014HB058）。

李純佳（1985-），男，湖北省十堰人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：甘蔗分子生理學(xué)，E-mail：welsper@126.com。

劉家勇（1976-），男，研究員，研究方向：甘蔗遺傳育種，E-mail：lljjyy1976@163.com。