張秀媛 何 擴 石 后 穆光達(dá)

（河北北方學(xué)院食品科學(xué)系河北北方學(xué)院食品科學(xué)研究所，張家口 075131）

響應(yīng)面法優(yōu)化小米紅曲制備工藝及其抗腫瘤活性研究

張秀媛 何 擴 石 后 穆光達(dá)

（河北北方學(xué)院食品科學(xué)系河北北方學(xué)院食品科學(xué)研究所，張家口 075131）

以小米為原料，研究制備小米紅曲工藝及其抗腫瘤活性。采用響應(yīng)面法對固態(tài)發(fā)酵小米紅曲制備的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對制備的小米紅曲進(jìn)行了體內(nèi)外抗腫瘤活性分析。結(jié)果表明，小米紅曲制備的最佳條件為：初始水分含量為42%、發(fā)酵溫度為28℃、發(fā)酵時間為14 d。小米紅曲350mg／kg／d對小鼠肝癌H22實體瘤體內(nèi)有明顯的抑制作用，其抑瘤率在30%以上；小米紅曲對H460、A549癌細(xì)胞體外亦有明顯的增殖抑制作用抑瘤；給藥方式以局部注射最好。表明小米紅曲在體內(nèi)外均具有一定的抗腫瘤活性。

小米紅曲 固體發(fā)酵 Box－Behnke 抗腫瘤

紅曲是紅曲霉（M.spurpureus）在生長代謝過程中產(chǎn)生的蒽醌衍生物，不僅應(yīng)用于釀酒、腐乳、食醋、食品色素等食品工業(yè)，而且具有能降低血壓、抑制膽固醇、提高人體免疫力、抑瘤抗癌等功效［1］。傳統(tǒng)紅曲采用秈米接種紅曲霉經(jīng)固體發(fā)酵而制得，而采用小米為原料生產(chǎn)的紅曲具有色價高、質(zhì)量好、發(fā)酵周期短等優(yōu)點。我國北方盛產(chǎn)小米（Setaria italica），小米的食用性單一，因此利用小米生產(chǎn)紅曲是小米深加工的一種理想方法，不僅可以增加小米的附加值，而且可以生產(chǎn)出高質(zhì)量的紅曲。

本研究采用響應(yīng)面法首先對固態(tài)發(fā)酵制備小米紅曲的小米飯的初始含水量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間的選擇進(jìn)行了優(yōu)化，獲得此技術(shù)制備小米紅曲的最佳工藝條件，然后采用C56BL／6小鼠為模型，系統(tǒng)研究了制備的小米紅曲對H22實體瘤體內(nèi)抑制以及對H460、A549癌細(xì)胞體外抑制活性研究，以期為小米紅曲的開發(fā)利用提供理論和實際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅曲霉：古田縣生華紅曲有限公司；小米：宣化巡天種業(yè)公司；PDA培養(yǎng)基：連云港邁克化工有限公司；環(huán)磷酰胺：南通制藥廠；5－氟脲嘧啶（5－Fu）：上海旭東海普藥業(yè)有限公司；MTT（噻唑藍(lán)）：北京賽馳生物科技有限公司。

小鼠肝癌H22：中國科學(xué)院上海藥物研究所；腫瘤H460、A549細(xì)胞：中國科學(xué)院細(xì)胞生物研究所；C56BL／6小鼠：斯萊克動物中心。

1.2 主要儀器

752紫外光柵分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；5410型二氧化碳培養(yǎng)箱：NAPCO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小米紅曲的制備［2］

將小米浸泡18 h，瀝干水，待水煮沸后，再將小米倒入蒸格內(nèi)，圓氣后蒸1 h至小米熟透無生心，然后將小米攤涼并打散。稱取一定量的小米放入150 mL三角瓶中，加入10%孢子懸浮液在一定溫度下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，接種72 h后每24 h加8%水并搖瓶，培養(yǎng)一定時間后，取出，在100℃下烘干，并測色價。

1.3.2 紅曲米色價的測定

采用GB 4926—2008［3］測定小米紅曲色價。

1.3.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，建立響應(yīng)值與影響因素間的數(shù)學(xué)模型，確定制備小米紅曲最佳條件。

1.3.4 小米紅曲抗腫瘤活性測定

1.3.4.1 體內(nèi)抑瘤試驗

分別設(shè)陰性對照組、小米紅曲250、350、450、環(huán)磷酰胺（陽性組）20mg／kg／d組。取H22肉瘤小鼠腹水，0.2 mL／只接種于C56BL／6小鼠右側(cè)腋下，接種后隨機分組，第2天起每天灌胃給藥，各組給藥體積均為0.3 mL／10 g體重，陰性對照組灌胃相同體積的生理鹽水。試驗第15日處死動物，取瘤稱重。按下式計算抑瘤率。

式中：A為陰性對照組平均瘤重；B給藥組平均瘤重。

1.3.4.2 體外抑瘤試驗

將0.8×105個生長至對數(shù)生長期的人腫瘤H460、A549細(xì)胞接種于96孔板，每孔80μL，同時加入不同劑量的小米紅曲溶液，每孔20μL，另設(shè)陰性對照組每孔加20μL培養(yǎng)液，陽性對照組加入20μL 5－Fu（5－氟脲嘧啶），使5－Fu的終濃度為10 μg／mL。將96孔板置5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）培養(yǎng)48 h，然后每孔加入噻唑藍(lán)溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后吸棄上清液。用酸化10%十二烷基磺酸鈉100 μL中止反應(yīng)，放置12 h后于570 nm處測定OD值。按下式計算抑制率，通過抑制率對藥物濃度作直線回歸方程，計算出IC50。

式中：C為陰性對照組OD均值；D為藥物處理組OD均值。

1.3.4.3 不同給藥方式對體內(nèi)抑制腫瘤的效果

取H22肉瘤小鼠腹水，0.2 mL／只接種于基本相同體重的C56BL／6小鼠右側(cè)腋下，接種后隨機分成灌胃、局部注射、腹腔注射3個組，將小米紅曲按大、中、小劑量（220、320、420mg／kg／d）給藥，各組給藥體積均為0.3 mL／10 g體重，陰性對照組灌胃相同體積的生理鹽水。試驗第15天處死小鼠，迅速剝離各試驗組腫瘤組織，取瘤稱重。抑瘤率計算按照步驟1.3.4.2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

取3次試驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS軟件作單因子方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 初始含水量對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響

裝料量為15 g、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間為9 d的情況下，研究了小米飯初始水分含量對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響，結(jié)果見圖1。隨著小米飯初始含水量的增加小米紅曲的色價升高，含水量45%時紅曲色價最高，此后色價越來越低。原因是小米飯含水量過高，導(dǎo)致小米飯?zhí)幱陴ず隣顟B(tài)，體系通氧困難，影響霉菌生長生產(chǎn)紅曲色素。

圖1 初始含水量對小米紅曲色價的影響

2.1.2 裝料量對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響

發(fā)酵溫度30℃、初始含水量45%、發(fā)酵9 d的情況下，研究了裝料量對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響，見圖2。在150 mL錐形瓶中，底物量為9～21 g時，對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響較小（P＞0.05），但是超過21 g后，小米紅曲的色價明顯降低，且在發(fā)酵過程中小米結(jié)塊并有異味產(chǎn)生。增多的底物量阻止紅曲霉呼吸氧氣，導(dǎo)致產(chǎn)色能力降低。

圖2 底物量對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響

裝料量15 g、初始含水量45%、發(fā)酵時間9 d的情況下，研究了發(fā)酵溫度對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響，見圖3。發(fā)酵溫度為25～30℃時，發(fā)酵良好；發(fā)酵溫度為20℃時，紅曲霉生長緩慢，并有雜菌生長；發(fā)酵溫度為35、40℃時，紅曲霉難以生長，可能是過高的溫度不適合紅曲霉的生長，并且過高的溫度使得水分蒸發(fā)過快，導(dǎo)致紅曲霉在生長過程中缺水。

圖3 發(fā)酵溫度對固態(tài)發(fā)酵制備小米紅曲的影響

2.1.4 發(fā)酵時間對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響

裝料量15 g、發(fā)酵溫度30℃、初始含水量45%的情況下，研究發(fā)酵時間對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響，見圖4。發(fā)酵初期底物顏色不斷變深，到發(fā)酵6 d后底物表面顏色不再變深，但是通過測色價發(fā)酵6 d后色價還在不斷明顯增高（P＜0.05），直到發(fā)酵15 d后色價增加不明顯（P＞0.05）。

圖4 發(fā)酵時間對固體發(fā)酵制備小米紅曲的影響

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

綜合單因素試驗結(jié)果，在150 mL錐形瓶中裝料量在9～21 g范圍內(nèi)對小米紅曲色價影響不顯著，所以試驗采用三因素三水平進(jìn)行分析（見表1），以1、2、3為自變量，小米紅曲色價Y為響應(yīng)值，響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見表2，根據(jù)表2通過Design－Expert8.0統(tǒng)計軟件對響應(yīng)面回歸過程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立響應(yīng)面的回歸模型，分析結(jié)果見表3。

由表3知，初始水分含量和發(fā)酵時間一次項、初始水分含量、發(fā)酵時間二次項達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），發(fā)酵溫度一次項達(dá)到顯著水平（P＜0.05），各項因素對提取率的影響經(jīng)回歸擬合后得到二次多項回歸模型，Y＝2 648.37－570.61X1－156.53X2＋717.88X3－116.55X1X2－375.24X1X3－31.98X2X3－1 204.65X12－310.80X22－403.05X32，該方程的相關(guān)系數(shù)R2＝0.977 0，整體模型P＜0.01，表明該二次方程模型達(dá)到極顯著，失擬項P＝0.051 2＞0.05，表明方程實擬不顯著。該方程對試驗擬合較好，模型能夠用于預(yù)測真實的試驗數(shù)據(jù)。通過Design Expert 8.0分析得出最佳制備小米紅曲條件為初始含水量42%、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時間14 d。在此條件下發(fā)酵制備的小米紅曲色價預(yù)測值為3 116.39 u／g。

表1 Box－Benhnken試驗設(shè)計因素和水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

根據(jù)響應(yīng)面試驗獲得的最佳工藝結(jié)果，在此條件下進(jìn)行驗證試驗。平行測定3次所獲小米紅曲色價平均值為3 114.2 u／g，試驗值與預(yù)測值接近。

2.3 小米紅曲抗腫瘤活性測定

2.3.1 體內(nèi)抑瘤活性結(jié)果

體內(nèi)抑瘤試驗結(jié)果表明小米紅曲各劑量組對小鼠肝癌H22均有一定的抑制作用，與腫瘤陰性對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.01，P＜0.05），350mg／kg／d組的抑制率為38.32%，450mg／kg／d組的抑制率分別為41.5%（見表4）。

表4 小米紅曲對小鼠肝癌H22的影響（±s，n＝10）

表4 小米紅曲對小鼠肝癌H22的影響（±s，n＝10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別劑量／mg·kg－1 ·d－1）動物數(shù)（前／后）動物體重／g（前／后）瘤重／g抑瘤率／% P值 顯著性**小米紅曲 350 10／10 22.1／27.2 0.84±0.28 38.32 0.030* 250 10／10 22.1／26.7 0.88±0.37 26.71 0.620 CTX 20 10／10 20.1／24.2 0.54±0.20 45.31 0.002**陰性對照組生理鹽水450 10／9 22.1／26.8 0.73±0.32 41.50 0.006 10／10 21.3／26.3 1.32±0.52

2.3.2 體外抑瘤活性結(jié)果

與陰性對照組相比，不同濃度的小米紅曲體外對H460、A549癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用（P＜0.01，P＜0.05），IC50分別為65.1、56.4μg／mL（見表5）。

表5 小米紅曲對H460、A549癌細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝10）

表5 小米紅曲對H460、A549癌細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量／μg／mL OD570 nm H460 A549小米紅曲 340 0.21±0.03** 0.25±0.05** 300 0.34±0.04** 0.31±0.02** 260 0.39±0.05** 0.41±0.05** 220 0.50±0.02** 0.48±0.03** 180 0.53±0.03* 0.52±0.04* 150 0.58±0.06* 0.56±0.05* 5－Fu 10 0.14±0.04** 0.23±0.02**陰性對照組 培養(yǎng)液0.74±0.03 0.67±0.03

2.3.3 不同給藥方式對體內(nèi)抑制腫瘤的效果

不同給藥方式對體內(nèi)抑制腫瘤的效果結(jié)果（見圖5），從圖5可以看出，3種給藥方式的抑瘤率都與劑量呈正相關(guān)，相同劑量下3種給藥方式抑瘤率效果大小為局部注射＞腹腔注射＞灌胃。采用局部注射給藥方式紅曲直接被吸收進(jìn)入血液產(chǎn)生作用，而腹腔注射和灌胃首先進(jìn)入腸道刺激腸道影響吸收，這些說明小米紅曲作為抑瘤劑具有時間和劑量依賴性，這與有關(guān)文獻(xiàn)報道一致［7－8］。

3 結(jié)論

3.1 研究了初始含水量、裝料量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對小米紅曲制備效果的影響，在150 mL錐形瓶中裝料量在9～21 g范圍內(nèi)對小米紅曲色價影響不顯著，通過響應(yīng)面分析得出最佳提取條件為：初始含水量為42%；發(fā)酵溫度為28℃；發(fā)酵時間為14 d。

圖5 不同給藥方式和不同劑量對抑瘤率的影響

3.2 體內(nèi)抑瘤試驗表明：小米紅曲250、350、450mg／kg／d對小鼠肝癌H22實體瘤都有抑制作用，當(dāng)劑量≥350mg／kg／d時，其抑瘤率在30%以上，試驗重現(xiàn)性良好且差異顯著；體外抑瘤試驗表明：小米紅曲對H460、A549癌細(xì)胞亦有明顯的增殖抑制作用，表明小米紅曲在體內(nèi)外均具有一定的抗腫瘤活性；給藥方式試驗表明：以局部注射方式抑制體內(nèi)腫瘤效果最好，同時表明小米紅曲作為抑瘤劑具有時間和劑量依賴性。

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Optimization of Production of Millet Red Rice Using
Response Surface Methodology and Their Antitumor Activity

ZhangXiuyuan He Kuo Shi Hou Mu Guangda
（Department of Food Science，Hebei North University，Institute of Food Science Hebei North University，Zhangjiakou 075131）

Optimization ofmillet red rice production was studied by response surfacemethodology and their antitumor activity was also determined.The results showed that the optimum production conditions were initialmoisture content42%，fermentation temperature 28℃and time 14 days.The inhibition ratio could reach over 30%when mice was treated by pressuremillet red rice at350mg／kg／d andmillet red rice could significantly inhibit cell growth of H460 and A549 cancer cell as to H22.The result showed that the local injection was the best feeding pattern.The three experiments all indicated thatmillet red rice had antitumor activityin vivoandin vitro.

millet red rice，solid－state fermentation，Box－Behnken，antitumor

TS218

A

1003－0174（2015）03－0019－05

張家口市科技攻關(guān)計劃（1012005C－10）

2013－11－04

張秀媛，女，1982年出生，講師，農(nóng)副產(chǎn)品加工與保藏