袁 建 王 艷 范 哲 李 倩 何 榮 鞠興榮

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210046）

Yuan Jian Wang Yan Fan Zhe Li Qian He Rong JuXingrong

（College of Food Science＆Engineering，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210046）

離子對色譜－ELSD檢測麥類中植酸的方法研究

袁 建 王 艷 范 哲 李 倩 何 榮 鞠興榮

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210046）

建立了應(yīng)用離子對色譜－蒸發(fā)光散射檢測（IPC－ELSD）麥類作物中植酸含量的方法，并結(jié)合電噴霧質(zhì)譜（ESI－MS）分析鑒定了各組分。色譜條件：C18色譜柱（5μm，4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相：甲醇－水（體積比60∶40，含0.4%正戊胺，甲酸調(diào)節(jié)pH為4.5）；流速1.0 mL／min；柱溫35℃。結(jié)果表明，植酸含量在0.25～5.0mg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＝0.999 1），檢測限為40μg／mL，平均回收率為90.44%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.13%。該方法快速、準(zhǔn)確，適用于麥類中植酸含量的測定。

離子對色譜 蒸發(fā)光散射檢測 麥類 植酸

植酸（phytic acid，InsP6）化學(xué)名肌醇－1，2，3，4，5，6－六磷酸二氫脂或肌醇己糖磷酸［1］，是一種小分子有機(jī)磷酸類化合物，廣泛存在于常見的食物中，在谷物種子、豆類及油料作物中含量較高，塊莖類和園藝產(chǎn)品中含量較低［2］。作為植物種子中磷酸和肌醇的主要貯存形式，植酸磷可達(dá)到總磷含量的70%［3］。植酸是一種多齒螯合劑，能夠與生物體內(nèi)的礦物質(zhì)離子及蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，對機(jī)體產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)作用，因此，被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子［4］。然而，隨著研究的深入，植酸獨(dú)特的生理活性引起廣泛關(guān)注，并被開發(fā)應(yīng)用到食品、藥物等領(lǐng)域［5］。

小麥、大麥、燕麥?zhǔn)俏覈饕柠滎愖魑?，Lolas等［6］研究發(fā)現(xiàn)，三者中的植酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.39%～1.35%，0.38%～1.16%，0.42%～1.16%，但麥類中植酸分析尚缺少有效的手段，麥類作物中植酸含量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)也還較為缺乏。

目前，植酸的分析常采用測鐵分光光度法［7］。該方法操作簡便，但不能區(qū)分植酸及其降解產(chǎn)物（IP5－IP4－IP3），精確度較低。結(jié)合現(xiàn)代色譜技術(shù)，國外學(xué)者做了大量的研究，包括了紫外檢測器和差示折光檢測器的應(yīng)用，但是植酸極性強(qiáng)，易電離，因此在反向色譜柱上保留時(shí)間極短；其結(jié)構(gòu)中無發(fā)色團(tuán)，因此無法直接利用紫外或熒光檢測器測定［8］，而采用示差折光檢測器時(shí)，對流動(dòng)相要求高，無法進(jìn)行梯度洗脫，待測組分與干擾成分分離較為困難。本試驗(yàn)以小麥為原料，采用離子對色譜分離，結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測，以改善植酸的保留、分離及檢測問題，以期建立一種新的有效的植酸檢測方法，為麥類資源綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑

小麥：市售，粉碎過80目篩，冰箱4℃保存。

植酸鉀（純度≥95%）、正戊胺（純度99%）、Dowex1×8氯型陰離子交換樹脂（200～400目）：Sigma；甲醇，色譜純：Merck；甲酸，色譜純：Roe。

1.2 儀器與設(shè)備

DionexUltimate3000高效液相色譜儀，配Acclaim 120 C18（5μm，4.6 mm×150 mm）色譜柱：美國Thermo Fisher公司；Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）：美國Grace公司；Agilent 1100 HPLC／MS（SL）型液質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司；4.5 L冷凍干燥機(jī)：美國labconco公司；Millpore超純水器：美國Millpore公司；JXFM110錘式旋風(fēng)磨：上海嘉定糧油儀器有限公司；離子交換柱（d1.4 cm×30 cm）：自制。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品前處理

2.1.1 陰離子交換柱的制備

稱取1 g樹脂用低濃度氯化鈉溶液浸泡后，加入預(yù)先鋪好脫脂棉、無水硫酸鈉并裝好3 cm水柱高的離子交換柱中，樹脂床形成后用蒸餾水淋洗至無鹽狀態(tài)［7］。柱子用15 mL，2 mol／L的鹽酸溶液平衡后用30 mL蒸餾水沖洗至無Cl－，備用［9］。整個(gè)操作過程中應(yīng)保持柱床垂直、穩(wěn)定。

2.1.2 植酸的提取與純化

樣品前處理參照Lee等［10］的方法略有改動(dòng)。樣品經(jīng)粉碎過80目篩后，精確稱取1.000 g于具塞錐形瓶中，加入20 mL，0.7 mol／L的鹽酸溶液，30℃條件下恒溫振蕩提取1 h。將提取后的混合液倒入離心管中，4 000 r／min離心10 min。取上清液進(jìn)行純化。

將上清液全部轉(zhuǎn)移入制備好的陰離子交換柱中后，先后以30 mL，0.1 mol／L的氯化鈉溶液和30 mL蒸餾水沖洗以去除雜質(zhì)和無機(jī)磷［11］。柱子中保留的植酸以30 mL，2 mol／L的鹽酸溶液，1 mL／min的流速洗脫，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，凍干并于－18℃保存。測定前用超純水溶解并定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后測定。

2.2 離子對色譜及液質(zhì)條件

2.2.1 離子對色譜條件

流動(dòng)相∶甲醇－水（60∶40，0.4%正戊胺，用甲酸調(diào)pH至4.5）；流速：1.0 mL／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL。

ELSD參數(shù)：霧化氣體：壓縮空氣；漂移管溫度：110℃；流量：2.5 L／min；增益：1。

2.2.2 液質(zhì)條件

液相：同2.2.1略有差異，由于質(zhì)譜對流動(dòng)相離子化的要求，流動(dòng)相調(diào)整為甲醇－水（60∶40，0.4%正戊胺，1%乙酸），進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜：電噴霧離子源（ESI）：負(fù)離子掃描模式，霧化氣N2∶25 psi，干燥氣N2∶9 psi，毛細(xì)管溫度：350℃，掃描范圍：100～2 000 m／z。

2.3 植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和水解液的制備

植酸鉀中磷元素的含量為24%，1mg植酸鉀固體中植酸的含量為0.86mg。因此，儲(chǔ)備液的制備可以準(zhǔn)確稱取0.059 0 g植酸鉀純品于10 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，冰箱4℃保存。

植酸水解液：取一定濃度的植酸鉀儲(chǔ)備液于試管中，水浴120℃加熱2 h，得到植酸不完全水解液，用于質(zhì)譜對植酸降解產(chǎn)物的分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

3.1.1 提取條件的優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了植酸提取的前處理方法。首先比較了鹽酸－水、鹽酸－甲醇及鹽酸－丙酮溶液3種提取劑對植酸的提取效果，并在此基礎(chǔ)上對提取液濃度、提取時(shí)間及提取溫度進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽酸水溶液對植酸的提取效果較好（提取率達(dá)1.27%），優(yōu)化得到的提取條件為鹽酸濃度0.7 mol／L，提取時(shí)間1 h，提取溫度30℃。

3.1.2 純化條件的優(yōu)化

提取后得到的溶液中雜質(zhì)較多，尤其是含有的無機(jī)磷酸鹽，會(huì)使測試結(jié)果偏高。通過純化可以對樣品進(jìn)行有效的凈化和富集。試驗(yàn)通過考察陰離子交換樹脂的吸附洗脫性能，確定了樹脂的用量（1 g樹脂～60mg植酸）及洗脫液體積（1 g樹脂～30 mL洗脫液）。經(jīng)過色譜分析，純化后得到的植酸粗產(chǎn)品中基本無雜質(zhì)峰，見圖1。

圖1 ELSD檢測樣品中植酸及其降解產(chǎn)物色譜圖

3.2 離子對色譜法的建立

3.2.1 檢測器的選擇

以甲醇和水為流動(dòng)相，采用液相DAD檢測器在200～400 nm波長范圍對其進(jìn)行3D圖譜采集，結(jié)果顯示，植酸在200～400 nm范圍內(nèi)無明顯吸收，與運(yùn)用紫外－可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描得到的結(jié)果一致。因此，從小麥中提取得到的植酸無紫外吸收，不宜用紫外檢測器進(jìn)行直接檢測。

蒸發(fā)光散射檢測器是通用型質(zhì)量檢測器，不依賴于物質(zhì)的光學(xué)特性，對檢測室中的非揮發(fā)性化合物也具有響應(yīng)［12］，可用于測定植酸及可能存在的降解產(chǎn)物。如圖1，蒸發(fā)光散射檢測器對樣品中的植酸及其降解產(chǎn)物存在響應(yīng)，檢測效果良好。

3.2.2 流動(dòng)相及離子對試劑的選擇

植酸為離子型化合物，極性較大，在反相鍵合相色譜柱上的保留時(shí)間相對較短，難以與液相色譜柱死時(shí)間進(jìn)行區(qū)分。選擇甲醇－水為流動(dòng)相，隨著甲醇比例的增大，植酸的保留時(shí)間略有延長。調(diào)整甲醇和水的比例對樣品進(jìn)行分離時(shí)，植酸及其降解產(chǎn)物在甲醇60%時(shí)分離效果較佳，但始終不能完全分離。綜合出峰時(shí)間及分離度2個(gè)因素考慮，確定流動(dòng)相基本組成為甲醇－水（60∶40）。

在流動(dòng)相中添加離子對試劑可以增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使分配系數(shù)增加，改善分離效果。試驗(yàn)選用了不同的離子對試劑，包括廣泛用于酸性化合物分析的四丁基氫氧化銨溶液以及正戊胺溶液。結(jié)果表明，銨鹽溶液由于不具有揮發(fā)性，因此在蒸發(fā)光散射檢測器內(nèi)產(chǎn)生較大的噪音，不適合直接檢測。正戊胺溶液易揮發(fā)，且對植酸的分離和保留效果良好，見圖2。

圖2 流動(dòng)相中加入正戊胺后的分離及保留圖

3.2.3 流動(dòng)相離子對濃度及pH優(yōu)化

試驗(yàn)考察了離子對試劑正戊胺的濃度及流動(dòng)相pH值對植酸保留及樣品分離效果的影響。結(jié)果顯示，植酸的保留時(shí)間隨離子對濃度的增加而增加。低濃度時(shí)，保留及分離效果不理想；高濃度時(shí)，峰明顯變寬并發(fā)生拖尾，如圖3。

圖3 流動(dòng)相中離子對濃度對分離及保留效果的影響

C18柱pH使用范圍一般為2～9。植酸呈酸性，應(yīng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH為酸性以抑制其解離，增加在固定相上的保留。選用甲酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，可同時(shí)改善峰形。流動(dòng)相pH過低時(shí)，保留時(shí)間較短，如圖4。

圖4 流動(dòng)相pH對樣品分離及保留效果的影響

綜合保留時(shí)間、分離度及峰形等因素，確定色譜條件為：甲醇－水（體積比60∶40，含有0.4%正戊胺，甲酸調(diào)節(jié)pH為4.5），流速為1.0 mL／min，柱溫35℃。在該條件下，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品中各組分完全分離，峰形良好，如圖5。

圖5 植酸標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜圖

3.2.4 植酸及雜質(zhì)峰定性

運(yùn)用質(zhì)譜對植酸標(biāo)準(zhǔn)品及試驗(yàn)樣品進(jìn)行分析。由于色譜條件略有改變及儀器本身的差異，在兩臺(tái)液相色譜儀上出峰時(shí)間以及峰形上略有差異，但整體峰圖一致。

對植酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行直接進(jìn)樣MS分析和色譜柱分離后MS檢測分析，得到的ESI質(zhì)譜圖如圖6所示。其中，經(jīng)色譜分離后得到的主峰的質(zhì)譜圖（圖6b）與直接進(jìn)樣所得到的質(zhì)譜圖（圖6a）一致。

對純化濃縮后得到的樣品進(jìn)行LC－MS分析，得到各個(gè)峰的質(zhì)譜圖。結(jié)果表明，樣品中主峰［植酸峰（IP6）峰］的質(zhì)譜圖（圖6c）與純品基本一致，證明該峰為植酸峰。圖5a中的IP5峰質(zhì)譜圖（圖6d）通過質(zhì)譜解析得出。此外，經(jīng)過液相空白進(jìn)樣及質(zhì)譜定性，表明樣品中的圖5a中的雜質(zhì)峰為進(jìn)樣峰。

圖6 植酸及雜質(zhì)峰質(zhì)譜圖

3.2.5 離子對色譜法分離效果考察

植酸在自然界中比較穩(wěn)定，樣品中的植酸可能會(huì)受到某些因素（如生長環(huán)境、加工方式等）的影響而發(fā)生降解，所以不同樣品中植酸降解產(chǎn)物的種類和含量各有不同。為了進(jìn)一步了解該離子對色譜方法對植酸及其降解產(chǎn)物的分離、檢測效果，運(yùn)用2.2的色譜及質(zhì)譜條件對2.3中制備好的植酸水解液進(jìn)行分析，得到的色譜圖如圖7所示。

經(jīng)過色譜分析，植酸水解液出現(xiàn)4個(gè)組分峰，其中2個(gè)與樣品中的IP5、IP6一致。經(jīng)過質(zhì)譜解析，4個(gè)組分峰豐度值最強(qiáng)的質(zhì)荷比依次為398.9、499.0、578.7、658.7，依次對應(yīng)IP3、IP4、IP5、IP6，前三者分別為植酸鉀純品的各級(jí)水解產(chǎn)物。4個(gè)峰的分離度值依次為2.27，3.15，3.91，2.87，由此可見，該方法對于植酸及其多級(jí)降解產(chǎn)物的分離效果良好。

圖7 植酸水解液的色譜圖

3.3 線性范圍考察及檢出限、定量限測定

取已制備的5mg／mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)系列的最終質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、5mg／mL。按2.2.1色譜條件，取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣20μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，植酸鉀在0.25～5.0mg／mL內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y＝262.79－69.115，R2＝0.999 1。

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐步稀釋并進(jìn)樣，并以信噪比為3時(shí)對應(yīng)的植酸濃度為檢出限（LOD），信噪比為10時(shí)對應(yīng)的植酸濃度為定量限（LOQ）。結(jié)果為檢出限40 μg／mL，定量限70μg／mL。

3.4 精密度試驗(yàn)

取植酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2.1色譜條件進(jìn)樣20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定各自的峰面積，植酸峰面積平均值為58.126 5，計(jì)算得到植酸的RSD為2.01%，表明該方法具有良好的精密度。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取相同質(zhì)量的粉碎過篩后的麥粉6份，按2.1的方法進(jìn)行樣品前處理，并按2.2.1的方法進(jìn)樣測定，記錄峰面積，得到的峰面積平均值為193.238 2相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.90%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一份3.5中得到的樣品溶液（4℃低溫、避光貯存），在2.2.1的色譜條件下，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣20μL，記錄植酸的峰面積，峰面積平均值為205.168 8，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.40%，表明植酸溶液在上述儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性較好。

3.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精確稱取已知植酸含量的同一樣品3份，分別向其中添加一定量的植酸鉀純品，并按2.1方法制備液相待檢溶液，按2.2.1離子對色譜方法進(jìn)樣測定植酸含量并計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果見表1，植酸的平均回收率為90.44%，RSD為3.13%，回收效果在可接受范圍內(nèi)。

表1 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3.8 樣品色譜圖

以小麥麩為試驗(yàn)材料，經(jīng)植酸提取、分離及純化的樣品前處理后，用建立的離子對色譜－蒸發(fā)光散射檢測法測定植酸的樣品色譜圖如圖8所示。

圖8 樣品色譜圖

4 結(jié)論

以小麥麩為試驗(yàn)材料，選擇和優(yōu)化了植酸提取、分離及純化的樣品前處理技術(shù)，使植酸及其多級(jí)降解產(chǎn)物得到了有效的分離，獲得了純度較高的植酸產(chǎn)品，建立了離子對色譜－蒸發(fā)光散射檢測法測定植酸含量的方法。本研究建立的HPLC方法精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性良好，由于麥類的結(jié)構(gòu)與組分類別相似，因此前處理及檢測方法適用于大麥、燕麥等麥類中植酸含量的檢測。

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Determination of Phytic Acid in Triticeae Crops by Ion－Pair High－Performance Liquid Chromatography with ELSD

Yuan Jian Wang Yan Fan Zhe Li Qian He Rong JuXingrong

（College of Food Science＆Engineering，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210046）

An ion－pair HPLC－ELSDmethod has been established through the research in the paper for determination of phytic acid in triticeae crops，which was combined with ESI－MS to identify the components.A C18 column（5μm，4.6 mm×150 mm，column temperature 35℃）was used jointly with themobile phase ofmethanolwater（60∶40，0.4%n－pentylamine，formic acid pH 4.5），at a flow rate of 1.0 mL／min.The calibration curve expressed a good linearity in the range of 0.25～5.0mg／mL（R2＝0.999 1）.The detection limit was 40μg／mL，and average recovery of 91.11%with RSD of 5.94%.Themethod is rapid and accurate，which is appropriate for the detection of phytic acid in triticeae crops.

IPC－ELSD，detection，triticeae crops，phytic acid

O657.7＋2

A

1003－0174（2015）

863計(jì)劃（2012AA101609）

2013－11－26

袁建，男，1965年出生，教授，食品質(zhì)量與安全03－0128－06