葉生愛，邢寶萍

（蘭州工業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州730050）

沙棘油對運動訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞的保護(hù)作用研究

葉生愛，邢寶萍

（蘭州工業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州730050）

從運動機(jī)體紅細(xì)胞自由基代謝與DNA損傷程度角度出發(fā)，進(jìn)行沙棘油對運動大鼠紅細(xì)胞的保護(hù)作用研究。結(jié)果表明沙棘油能明顯提高運動大鼠紅細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）活性，降低紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量，保護(hù)紅細(xì)胞及其DNA免受脂質(zhì)過氧化損傷，增強(qiáng)運動能力。

沙棘油；紅細(xì)胞；氧化損傷；運動訓(xùn)練

研究證實，劇烈運動可促使活性氧產(chǎn)生，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，丙二醛（MDA）水平升高而導(dǎo)致運動能力下降，產(chǎn)生運動性疲勞。本文從紅細(xì)胞角度研究自由基對運動機(jī)體的損傷和沙棘油對機(jī)體的保護(hù)作用。

沙棘果實和葉中富含多種維生素、黃酮、甾醇、類脂、氨基酸和微量元素等藥用成分和營養(yǎng)物質(zhì)，沙棘果實是我國古代藏、蒙醫(yī)治病的常用藥物，具有抗癌抑瘤、增加免疫力的功能，能祛痰利肺，協(xié)調(diào)肝、胃、脾、腎和心臟功能，能活血化瘀、消炎生肌，也能防輻射、抗衰老。此外，沙棘還能阻斷過氧化作用，消除體內(nèi)過氧化產(chǎn)生的自由基[1]。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

8 周齡SD雄性大鼠32只，體重（200±20）g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為4組：安靜＋生理鹽水對照組（對照1組）、安靜＋沙棘油組（實驗1組）、遞增負(fù)荷訓(xùn)練＋生理鹽水對照組（對照2組）、遞增負(fù)荷訓(xùn)練＋沙棘油組（實驗2組），每組8只。

1.2 訓(xùn)練方式及給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，對照1組、實驗1組不進(jìn)行遞增負(fù)荷的運動訓(xùn)練；對照2組、實驗2組安排在水池中進(jìn)行游泳訓(xùn)練，水溫控制在（30±1）℃，水深60 cm，密度6只/m2。動物飼養(yǎng)室內(nèi)溫20～26℃，濕度為44%～70%，照明隨自然變化。對照1組、實驗1組安靜籠飼養(yǎng)，自由飲食、攝水。對照2組、實驗2組每天下午訓(xùn)練一次，每周訓(xùn)練5天，訓(xùn)練4周；開始每天訓(xùn)練30分鐘，適應(yīng)1周，第二周第一天訓(xùn)練30分鐘，以后每天加5分鐘，第三周第一天訓(xùn)練50分鐘，以后每天加5分鐘，第四周第一天訓(xùn)練70分鐘，以后每天加5分鐘，第五天訓(xùn)練結(jié)束后于次日4組負(fù)重（體重的6%）游泳至力竭（力竭標(biāo)準(zhǔn)為大鼠沉入水中超過10 s），用電子秒表記錄游泳時間。對照組每天按2.5m l/kg劑量灌胃生理鹽水，實驗組每天按2.5ml/kg劑量灌胃沙棘油。沙棘油由甘肅省輕工業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.3 取材

游泳大鼠力竭后即刻斷頭取血，肝素抗凝，測各項指標(biāo)。

1.4 測試指標(biāo)及方法

（1）超氧化物歧化酶（SOD）測定采用黃嘌呤氧化酶法，丙二醛測定采用硫代巴比妥酸法，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）測定采用DTNB法。均按南京建成生物工程研究所提供的測試盒說明書操作。

（2）紅細(xì)胞DNA損傷采用彗星分析法，即在熒光顯微鏡下，每片隨機(jī)觀察約100個紅細(xì)胞，依據(jù)DNA在“彗星細(xì)胞”尾部的量判定DNA損傷程度。在西北師范大學(xué)生命科學(xué)院實驗室測試。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，對各指標(biāo)與對照組之間的差異進(jìn)行組間t檢驗，顯著性水平定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 沙棘油對大鼠力竭游泳時間的影響（見表1）

表1 沙棘油對大鼠力竭游泳時間的影響（±s,h）

表1 沙棘油對大鼠力竭游泳時間的影響（±s,h）

注：*表示與對照1組比較P＜0.05，#表示與實驗1組比較P＜0.05，Δ表示與對照2組比較P＜0.05

組別動物數(shù)力竭游泳時間對照1組8 4.15±0.68#Δ實驗1組8 4.94±0.53*Δ對照2組8 5.11±0.55*#實驗2組8 5.68±0.49#Δ

表1顯示，與對照組比較，實驗組力竭游泳時間明顯延長，且有顯著性差異（P＜0.05）；與對照1組、實驗1組比較，對照2組、實驗2組力竭游泳時間明顯延長，且有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 沙棘油對大鼠紅細(xì)胞中SOD、CSH-Px活性及MDA含量的影響（見表2）

表2 沙棘油對大鼠紅細(xì)胞中SOD、CSH－Px活性及MDA含量的影響（±s）

表2 沙棘油對大鼠紅細(xì)胞中SOD、CSH－Px活性及MDA含量的影響（±s）

注：*表示與對照1組比較P＜0.05，#表示與實驗1組比較P＜0.05，Δ表示與對照2組比較P＜0.05

組別SOD（U/g·Hb）MDA（nmol/ml）GSH－PX（U/ml）對照1組1517.27±218.68*2.89±0.23*40.33±1.21*Δ實驗1組1 765.42±242.01*2.76±0.19*43.80±1.54*Δ對照2組1684.65±189.47*2.70±0.26*46.21±0.70*Δ實驗2組1 838.56±210.45Δ2.24±0.32Δ48.80±1.32#Δ

2.2.1 對紅細(xì)胞SOD活性的影響從表2可以看出，兩個對照組相比，SOD活性無顯著差異；而1組與2組相比，SOD活性均無顯著性差異，但實驗2組高于實驗1組。

2.2.2 對紅細(xì)胞MDA含量的影響表2顯示，實驗組與對照組MDA含量均有顯著性差異（P＜0.05）；對照組雖有下降趨勢，但無顯著性差異；與1組比較，對照2組無顯著性差異，但有下降趨勢，實驗2組有顯著性差異。

2.2.3 對紅細(xì)胞GSH-Px活性的影響表2顯示，與對照組比較，實驗組均有顯著性差異（P＜0.05）；與1組比較，2組GSH－Px活性有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 沙棘油對運動訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞中DNA的作用（見表3）

表3 運動對大鼠紅細(xì)胞DNA損傷實驗結(jié)果（±s）

表3 運動對大鼠紅細(xì)胞DNA損傷實驗結(jié)果（±s）

注：*表示與對照1組比較P＜0.05，#表示與實驗1組比較P＜0.05，Δ表示與對照2組比較P＜0.05

組別計數(shù)細(xì)胞（個）彗星樣紅細(xì)胞出現(xiàn)率（%）對照1組100 28.48±1.77*Δ實驗1組100 20.85±1.34*Δ對照2組100 26.37±5.32*Δ實驗2組100 18.64±4.36#Δ

表3顯示，與對照組相比較：實驗1組與實驗2組均有顯著性差異（P＜0.05）。與1組比較，對照2組與實驗2組均有顯著性差異（P＜0.05）。

3 分析與討論

3.1 沙棘油對大鼠力竭游泳時間的影響

大鼠力竭游泳時間是機(jī)體抗應(yīng)激能力、抗疲勞能力等的綜合體現(xiàn)。研究結(jié)果顯示，實驗2組的力竭游泳時間明顯長于對照2組（P＜0.05），可以推測沙棘油具有一定的抗疲勞作用。這主要是由于沙棘油含有黃酮類、VE、VC、SOD等抗氧化劑，這些成分能有效清除運動過程中產(chǎn)生的自由基，保護(hù)紅細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等。

3.2 沙棘油對運動訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞SOD、GSH-Px活性的影響

長時間劇烈運動需要機(jī)體處于高氧環(huán)境，導(dǎo)致氧自由基生成過多，攻擊紅細(xì)胞膜，使之結(jié)構(gòu)受損。而紅細(xì)胞中的SOD、GSH－Px能快速清除氧自由基，在運動中活性明顯增高，對于消除自由基對紅細(xì)胞的損傷、改善紅細(xì)胞的運氧能力、延緩運動性疲勞的發(fā)生具有重要意義，同時直接影響能量的釋放和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。于基國[2]認(rèn)為酶活性的改變與訓(xùn)練強(qiáng)度及時間有關(guān)。李磊[3]研究發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度訓(xùn)練使大鼠紅細(xì)胞抗氧化酶產(chǎn)生適應(yīng)性變化，表現(xiàn)為SOD活性明顯增強(qiáng)、GSH－Px活性無顯著變化，改善紅細(xì)胞的運氧功能，延緩運動性疲勞的發(fā)生。章江洲[4]發(fā)現(xiàn)力竭運動引起SOD活性升高可能是機(jī)體對長時間劇烈運動產(chǎn)生的自由基的防御反應(yīng)。

實驗結(jié)果顯示，大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練可使大鼠紅細(xì)胞中SOD、GSH－Px活性升高，這可能是因為不同的酶活性對運動刺激的適應(yīng)能力不同而造成的。服用沙棘油后，不論是實驗1組還是實驗2組，這3種抗氧化酶活性都明顯升高，說明沙棘油可提高紅細(xì)胞的抗氧化酶活性，其原因可能是：沙棘油作為外源性抗氧化劑，可以加快紅細(xì)胞中自由基的清除；運動可產(chǎn)生自由基，自由基又可使抗氧化酶活性代償性增強(qiáng)；通過其他代償調(diào)節(jié)提高細(xì)胞中SOD、GSH－Px的合成能力。

3.3 沙棘油對運動訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞MDA含量的影響

MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的重要代謝產(chǎn)物，其對細(xì)胞具有嚴(yán)重的毒性作用。紅細(xì)胞含量也可在一定程度上反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除情況，因為脂質(zhì)過氧化起因于結(jié)合或游離狀態(tài)的不飽和脂肪酸與自由基的相互作用[5]。實驗研究表明，運動狀態(tài)下組織MDA含量低于安靜狀態(tài)。

本實驗研究表明，實驗1組、實驗2組紅細(xì)胞MDA含量分別低于對照1組、對照2組，說明沙棘油對大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化有非常明顯的抑制作用。其機(jī)制是：沙棘油含有的黃酮、二菇酚類等成分，具有很強(qiáng)的抗氧化作用；沙棘油增強(qiáng)了紅細(xì)胞中SOD、GSH－Px等抗氧化酶的活性，加快了自由基的清除。

3.4 沙棘油對運動訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用

彗星實驗（Comet Assay）[6，7]即單細(xì)胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis，SCGE）實驗，是一種靈敏的DNA損傷檢測方法。各種因素誘發(fā)DNA損傷產(chǎn)生斷鏈時，會影響DNA高級結(jié)構(gòu)，使其超螺旋松散破壞。在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜及其他膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA及其他成分均可進(jìn)入凝膠而擴(kuò)散到裂解液中，而核DNA分子量很大，不能進(jìn)入凝膠，只能留在原位。在堿處理和堿性電泳作用下DNA解螺旋，使DNA的斷鏈和堿易變性DNA片斷從嚴(yán)密的超螺旋結(jié)構(gòu)中釋放出來。由于這些DNA斷鏈分子量小且堿易變性DNA為單鏈，所以在電泳電場中就可以離開核DNA，在凝膠分子篩中向陽極移動，產(chǎn)生一個尾狀帶，而未損傷的DNA部分保持球形，并停留在原位，二者形成彗星狀圖像。因此，可根據(jù)彗星樣細(xì)胞發(fā)生率（拖尾率）和彗星尾長（拖尾尾長），定量檢測單個細(xì)胞中的核DNA損傷程度，進(jìn)而了解整個細(xì)胞、組織、器官內(nèi)DNA損傷程度。運動造成的細(xì)胞DNA損傷與運動強(qiáng)度、運動方式等有關(guān)[8]，我們利用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)對運動大鼠紅細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)力竭運動后對照2組紅細(xì)胞中DNA的損傷程度明顯低于對照1組，實驗1組明顯低于對照組，可能是由于沙棘油含大量黃酮、VC、VE等對抗自由基抗氧化作用的物質(zhì)，從而使紅細(xì)胞盡可能避免自由基的損傷。

4 小結(jié)

（1）沙棘油可以明顯提高大鼠游泳至力竭的時間，說明沙棘油對促進(jìn)運動能力的提高具有積極意義。

（2）服用沙棘油可明顯提高大鼠紅細(xì)胞SOD和GSH－Px活性，降低MDA含量，說明沙棘油對增強(qiáng)紅細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的能力、減少自由基對機(jī)體的損傷具有重要作用，同時對延緩運動性疲勞的發(fā)生和發(fā)展具有積極作用。

[1]句海松，李小潔，趙寶路，等.沙棘總黃酮對活性氧自由基的清除作用[J].中國藥理學(xué)通報，1990，6（2）：97.

{2]于基國.不同運動強(qiáng)度對紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，1997，16（2）：146－147.

[3]李磊.抗疲勞中藥對大強(qiáng)度訓(xùn)練大鼠紅細(xì)胞抗過氧化酶活性的影響[A]//第五屆全國體育科學(xué)大會論文摘要匯編[C].1997.

[4]章江洲.力竭性游泳對小鼠紅細(xì)胞腺普脫氨酶及SOD活性的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，1999，18（2）：160－161.

[5]陳吉棣，曹國華，陳志民，等.健力寶——低熱量飲料對大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝影響的研究[J].體育科學(xué)，1992，12（2）：49.

[6]Vcn Remmen H，Hamilton M L，Richardson A.Oxidative damage to DNA and aging[J].Exerc Sport Sci Rev，2003，31（3）：149-153.

[7]Singh N P.Technical report：modification of alkaline microgel electrophoresis for sensitive detection of DNA damage[J].Int Radiat Biol，1994（66）：23.

[8]孟紫強(qiáng).應(yīng)用彗星實驗研究細(xì)胞DNA損傷的原理和方法[J].中國公共衛(wèi)生，1998，14（7）：425.

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