孫海燕，陳偉國，董久鳴，楊一平，張芬

（1.海寧市蠶桑技術服務站，浙江海寧 314400；2.浙江省農(nóng)技推廣中心，浙江杭州 310020）

酶抑制速測儀檢測桑葉農(nóng)藥殘留的前處理方法優(yōu)化

孫海燕1，陳偉國1，董久鳴2，楊一平1，張芬1

（1.海寧市蠶桑技術服務站，浙江海寧 314400；2.浙江省農(nóng)技推廣中心，浙江杭州 310020）

酶抑制法速測是檢測農(nóng)產(chǎn)品中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的簡便、快捷方法。采用CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀，考察不同桑葉樣本對檢測抑制率的影響。結果表明：桑葉樣本碎小、浸提過程中振蕩處理都會提高抑制率，造成檢測結果的假陽性；嫩葉的抑制率明顯低于成熟桑葉；強桑1號和農(nóng)桑14號2個桑品種的抑制率接近。據(jù)此，提出了應用酶抑制速測儀的桑葉前處理方法，用該方法檢測無毒桑葉建立校準曲線，導入CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀標準對照庫，便于用戶檢測桑葉時參照，提高檢測結果的可靠性。

酶抑制法；農(nóng)藥殘留；快速檢測；桑葉；方法

利用酶抑制原理快速檢測農(nóng)產(chǎn)品中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留在我國已經(jīng)得到廣泛應用，具有快速方便、前處理簡單、成本較低等優(yōu)點，可實現(xiàn)現(xiàn)場定性和半定量測定，適用于對農(nóng)藥殘留進行粗篩。近年來，農(nóng)殘速測作為保障農(nóng)產(chǎn)品質量安全的一項重要措施得到廣泛重視，鄉(xiāng)鎮(zhèn)一級基本都已配備整套農(nóng)殘速測儀器，甚至有的村或合作社或生產(chǎn)基地都已開始應用。海寧作為蠶桑主產(chǎn)區(qū)，多年來受到糧食作物使用農(nóng)藥污染桑葉的困擾，迫切需要簡便、有效的桑葉農(nóng)殘檢測技術，為此，我們將全市統(tǒng)一使用的CL-BⅢ八通道殘留農(nóng)藥測定儀用于檢測桑葉農(nóng)藥殘留，旨在為養(yǎng)蠶安全提供主動、快捷的預檢預防技術。

由于酶抑制法對生化反應條件要求嚴格，在檢測過程中會受到多種因素干擾，檢測結果易出現(xiàn)假陽性等問題［1］。國家標準GB/T 5009.199—2003中特別說明：蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質，容易產(chǎn)生假陽性［2］。經(jīng)前期檢測對比發(fā)現(xiàn)，CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀按照常規(guī)方法檢測無毒桑葉樣本的抑制率偏高，表明桑葉樣本及其前處理方法可能存在干擾檢測結果的某些因素。為此開展了相關試驗研究，探索適用于桑葉農(nóng)藥殘留檢測的樣本前處理方法，提高檢測結果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

儀器：CL-BⅢ八通道殘留農(nóng)藥測定儀（上海復博農(nóng)業(yè)科技有限公司）；電子天平，精確度0.1 g；HY-4調速多用振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；可調移液槍，2～100 μl，50～5000 μl；其它玻璃儀器；CCM-200 PLUS葉綠素含量測量儀（美國OPTI-sciences）。

試劑：CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀配套試劑：提取液，酶試劑，顯色劑，底物，由上海復博農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

檢測材料：農(nóng)桑14號桑葉，強桑1號桑葉。

1.2 檢測方法

樣品檢測：按照CL-BⅢ八通道殘留農(nóng)藥測定儀標準操作方法對不同試驗樣本進行檢測，單因素對比處理重復不少于6次。具體步驟如下。

稱取1 g桑葉樣品，剪碎后放入提取瓶內，加入5 ml提取液，浸提15 min；從中抽取2.5 ml浸泡后的提取液，移至空試管內，分別加入100 μl酶試劑、100 μl顯色劑，靜置15 min后，再加入100 μl底物，迅速搖勻后倒入比色皿中，放入酶速測儀比色池進行檢測。

結果判定：儀器檢測結果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。為了直觀顯示檢測結果，CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀軟件把檢測的抑制率≥50%時判定為不合格，表明樣品中有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結果。抑制率≤50%時判定為合格，樣品為陰性結果。

1.3 處理設置

1.3.1 桑葉表面清洗處理對比

選取無損傷的成熟桑葉，沿主葉脈剪成兩半，一半在清水中輕輕漂洗1 min后自然晾干，另一半不清洗。兩種待測桑葉剪成1 cm左右的小方塊，然后按標準操作方法同時檢測，對比兩者檢測。

1.3.2 浸提過程振蕩與否對比

同一片桑葉一分為二，剪成1 cm左右的小方塊，加入提取液浸15 min；其中一種將提取瓶置于振蕩儀上低速振蕩3 min；另一種每隔5 min用手搖晃提取瓶10下，共3次，兩者同時檢測對比。

1.3.3 桑葉樣本剪切大小對比

同一片桑葉一分為二，一半用剪刀剪成1 cm左右的小方塊，另一半剪成整塊，由于5 ml提取液不能完全浸沒過大的葉塊，兩種處理均改為2 g桑葉樣品加入10 ml提取液。整塊桑葉操作方法為：剪成4 cm左右的長方條，稱準2 g，先卷成1 cm直徑的圓筒，彎成圓弧后放入得取瓶底部，加入提取液搖勻，檢測方法相同，比較桑葉樣本大小的抑制率差異。

1.3.4 不同葉位桑葉對比

選取無損傷的枝條中下部成熟桑葉和上部較嫩桑葉，選用葉綠素快速測定儀測葉綠素含量，然后按1.3.3方法測定酶抑制率，比較不同葉位桑葉的葉綠素含量及其對比色結果的影響。

1.3.5 不同桑品種的檢測對比

在同一桑園中分別從農(nóng)桑14號和強桑1號上采摘枝條中下部相同葉位的成熟桑葉，按1.3.3方法測定酶抑制率。

2 結果與分析

圖1 桑葉表面清洗與不清洗對抑制率的影響Figure 1Effect on the inhibition rate of mulberry leaves cleaning

2.1 桑葉表面清洗對檢測的影響

桑樹生長環(huán)境、生長時間和降雨等不同，桑葉表面的塵土等附著物相差很大，可能對速測儀比色結果產(chǎn)生干擾。圖1為同一片成熟桑葉剪成兩半后一半清水漂洗1 min后自然晾干，另一半不清洗，按標準操作方法同時檢測，兩者的檢測結果平均值和標準差都接近，表明農(nóng)藥殘留速測儀對桑葉表面不必進行預先清洗。

2.2 浸提過程中振蕩與否對比

從圖2可見，待檢桑葉加入提取液后用振蕩儀的抑制率明顯高于用手搖晃的數(shù)據(jù)，可能是浸提過程中持續(xù)振蕩導致桑葉組織內物質進入提取液。

圖2 桑葉浸提過程振蕩與否對抑制率的影響Figure 2Effect on the inhibition rate of oscillation during the extraction process

2.3 桑葉大小對抑制率的影響

為保證待測桑葉完全浸入提取液中，一般要求將桑葉剪成1 cm左右的小方塊，由于桑葉汁液豐富、葉綠素含量高，剪得越碎可能導致組織液滲出量越多，對比色法檢測結果的影響更大。此外，農(nóng)藥殘留速測儀通常把50%的抑制率設定為是否合格界線，從清洗、振蕩等前期試驗采用小塊桑葉浸提的檢測結果看，多數(shù)抑制率在50%以上，儀器自動判定檢測結果為不合格。從圖3可見，整葉的抑制率確實明顯低于碎葉，說明可有效防止桑葉組織液的浸出，或者說有助于降低對檢測的干擾。

圖3 桑葉大小形狀對抑制率的影響Figure 3Effect on the inhibition rate of mulberry leaves size and shape

2.4 桑葉葉位對抑制率的影響

從圖4可以看出，成熟葉的抑制率高于嫩葉，成熟葉的葉綠素含量同樣高于嫩葉，表明不同葉位桑葉的老嫩程度和葉綠素含量存在相關性，葉綠素含量的高低與檢測抑制率呈正相關。

圖4 桑葉葉位對抑制率的影響Figure 4Effect on the inhibition rate of mulberry leaves position

2.5 不同桑品種對抑制率的影響

圖5可見，農(nóng)桑14號和強桑1號成熟桑葉的抑制率數(shù)據(jù)比較接近，農(nóng)桑14號略高于強桑1號，可能與農(nóng)桑14號葉色深綠有一定關系。檢測結果表明，農(nóng)藥殘留速測儀對農(nóng)桑14號和強桑1號空白桑葉的檢測結果無明顯差異。

圖5 不同桑品種與抑制率的關系Figure 5Relationship between different mulberry varieties and inhibition rate

2.6 桑葉樣品前處理方法與標準對照的建立

為了解決部分果蔬檢測結果的假陽性問題，CLBⅢ殘留農(nóng)藥測定儀電腦版專用軟件建立了30種果蔬的標準對照庫。通過CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀對大量桑葉樣品的檢測，確定了桑葉樣本采集和前處理方法，以此方法測定無毒桑葉，對檢測數(shù)據(jù)進行處理后生成桑葉標準對照。用戶需要使用CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀檢測桑葉樣品的，可從上海復博農(nóng)業(yè)科技有限公司網(wǎng)頁下載桑葉標準對照。

3 小結與討論

3.1 假陽性的消除

減少或消除酶抑制速測法中假陽性的影響，提高對樣品中農(nóng)藥殘留快速檢測的準確性，報道了加熱、調節(jié)酸堿度等不同的前處理方法［1，3-5］。但這些方法在檢測桑葉樣本時是否適用，或者說增加過多的前處理設備與快速檢測方法不相吻合。本試驗采用比較簡單、可操作性較強的方法，有效降低了空白桑葉樣品的抑制率，減少了產(chǎn)生假陽性的可能。

3.2 桑葉樣本的采集

果蔬類樣品通常在其成熟期或采摘期前進行檢測，不同品種大致都有內在一致性。而桑葉作為檢測對象時，生長期相差極大，小蠶吃的嫩葉生長還不到10 d，大蠶吃的成熟葉有可能超過50 d。對比結果表明，不同葉位桑葉的老嫩程度和葉綠素含量以及抑制率的高低都存在相關性，枝條頂部嫩葉的葉綠素含量低，檢測的抑制率也低。相對來說，枝條中部成熟桑葉的生長期略長于大多數(shù)有機磷類與氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘毒期，因此作為檢測樣本的代表性較強。

3.3 檢測桑葉的前處理方法

當CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀用于檢測桑葉農(nóng)殘時，也要參考儀器檢測的判定結果，通過對無毒桑葉不同處理方法檢測對比表明：桑葉樣本碎小、浸提過程中振蕩處理的抑制率明顯提高，儀器判定不合格，表現(xiàn)為檢測結果的假陽性；而嫩葉的抑制率明顯低于成熟桑葉，可能導致檢測結果的假陰性。而這種偏離現(xiàn)象可以通過調整優(yōu)化樣品的前處理方法得以糾正。因此，根據(jù)試驗結果確定了桑葉樣品的前處理方法為：采摘枝條中部無損傷的成熟葉片，剪成大塊整葉浸入提取液中15 min，期間每隔5 min用手搖晃提取瓶10下，共3次，后續(xù)檢測按常規(guī)方法操作。

3.4 桑葉檢測的標準對照庫應用

基于上述桑葉樣本選定和前處理方法測定的清潔桑葉抑制率數(shù)據(jù)建立校正曲線，導入到CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀標準對照庫，在檢測桑葉樣本時從標準對照庫中選擇桑葉，儀器檢測過程中對照標準庫校正后的結果輸出抑制率數(shù)據(jù)。當然，如果桑葉樣本和前處理不參照本方法的，也可進行檢測，但是每次檢測時必須要添加一個空白對照。

3.5 檢測結果判定的參考指標

酶抑制快速檢測原理是利用抑制率與農(nóng)藥殘留正相關的關系，但不同農(nóng)藥達到相同抑制率的殘留濃度差異較大［6］，因而提出抑制率在40%～70%時為農(nóng)殘可疑超標，應當重復檢測。具體到儀器自動判定檢測結果時，必須設置一個參考數(shù)值，CL-BⅢ殘留農(nóng)藥測定儀把＜50%的抑制率作為鑒別合格的參照標準，能夠適用于絕大多數(shù)的檢測。

家蠶是一種對化學物質極為敏感的經(jīng)濟昆蟲，常因農(nóng)藥污染導致重大經(jīng)濟損失［7］。將農(nóng)殘快速檢測儀用于桑葉檢測既擴展了適用范圍，又為蠶桑生產(chǎn)安全提供了一種主動預防措施，但還需要不斷完善。對于桑葉農(nóng)殘檢測，關鍵是掌握實際殘留量對家蠶的影響程度，建立檢測抑制率與生物毒性的對應關系。

［1］桑園園，柴麗娜，魏朝俊，等.酶抑制法檢測4種辛辣蔬菜農(nóng)藥殘留假陽性消除的研究［J］.中國農(nóng)學通報，2009，25（11）：60～64.

［2］GB/T 5009.199—2003，蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量快速檢測［S］.

［3］鄭金武，江曉燕.蔬菜農(nóng)藥殘留快速檢測中消除假陽性的檢測方法［J］.安徽農(nóng)學通報，2012，18（19）：189，192.

［4］葛靜，王素利，錢傳范，等.韭菜中農(nóng)藥殘留酶速測法假陽性消除研究［J］.食品科學，2008，29（4）：299～301.

［5］王文，劉瑾，盛偉楠，等.采用酶抑制法檢測大蒜中農(nóng)藥殘留的改進方法［J］.食品科學，2013，34（12）：135～139.

［6］裘正軍，陸江峰，何勇.基于酶抑制法的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留快速檢測系統(tǒng)及影響因素分析［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2007，23（9）：229～233.

［7］魯興萌.養(yǎng)蠶中毒的原因分析和防范［J］.蠶桑通報，2008，39（1）：1～5.

Pre-treatment Methods Optimization of Enzyme Inhibition for Rapid Detection of Pesticide Residues in Mulberry Leaves

SUN Hai-yan1,CHEN Wei-guo1,DONG Jiu-ming2,YANG Yi-ping1,ZHANG Fen1
（1.Haining Sericulture Technology Service Station,Jiaxing 314400 Zhejiang,China; 2.Zhejiang Province Agricultural Technology Promotion Center,Hangzhou 310020,China）

Enzyme inhibition rapid detection is a simple and rapid method for the determination of residual organic phosphorus and amino acid ester pesticide residues in agricultural products.CL-BⅢpesticide residue detectors were used to detect the effects of different mulberry leaf samples on inhibition rate.The results showed that,small pieces of mulberry leaf samples and oscillating treatment in extraction process would increase inhibition rate,and false positive results were detected.The inhibition rate was significantly lower than that of mature leaves of mulberry leaves.The inhibition rate of the 2 mulberry varieties‘Qiangsang NO.1’and‘Nongsang NO.14’were close.Pre-treatment Methods optimization of enzyme inhibition for rapid detection were proposed.The calibration curve was established by detecting nontoxic mulberry leaves,and imported into the standard control library of CL-BⅢpesticide residue detector to facilitate detection of mulberry leaves and improve the reliability of test results.

enzyme inhibition;pesticide residue;rapid detection;mulberry;method

S882.2

A

0258-4069［2015］04-020-04

孫海燕（1980-），男，浙江海寧人，本科，農(nóng)藝師。主要從事蠶桑技術的運用與推廣。E-mail：sunhy123@hotmail.com