蔡學(xué)堅王東軍陳苑新魏長新黃劍

大鼠皮質(zhì)受損區(qū)域Cdk5與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究

蔡學(xué)堅①王東軍②陳苑新①魏長新①黃劍①

目的：研究皮質(zhì)受損區(qū)域細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5（Cyclin-dependent kinase 5，Cdk5）與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法：采用Feeney’s自由落體模型制作大鼠顱腦損傷模型，隨機分為2 h、1 d、3 d及7 d組，用免疫組化的方法檢測創(chuàng)傷性腦損傷后受損腦皮質(zhì)區(qū)域中Cdk5的表達情況；TUNEL方法檢測該區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況；WesternBlotting方法檢測蛋白Cdk5時序表達水平變化的情況。結(jié)果：大鼠受損皮質(zhì)區(qū)域Cdk5表達隨時間增加而增加，7 d達到高峰；受損皮質(zhì)區(qū)域凋亡陽性細(xì)胞變化趨勢與Cdk5基本一致；細(xì)胞凋亡系數(shù)與Cdk5呈正相關(guān)性（r=0.88，P＜0.05）。對照組無明顯變化。結(jié)論：大鼠皮質(zhì)區(qū)域損傷可誘導(dǎo)Cdk5數(shù)量及激酶活性增加，從而參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

顱腦損傷； 細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5； 細(xì)胞凋亡

Cdk5為絲/蘇氨酸胞周期素依賴蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase，Cdk）家族一類成員，存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，含292個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為33×103，激活后可磷酸化不同的相關(guān)底物。到目前為止鑒定出的Cdk5底物約有20余種，包括蛋白激酶K、Tau蛋白、神經(jīng)絲蛋白及β-連環(huán)蛋白等[1-5]。近年來，在腦缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)Cdk5是神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中重要的上游因子[6-7]。然而，到目前為止關(guān)于Cdk5與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性在大鼠損傷模型中國內(nèi)外鮮有報道，因此闡明顱腦損傷后Cdk5與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，對臨床尋找新的治療靶點有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑 免疫組化染色試劑盒：北京中杉金橋生物公司。Anti -Cdk5：貨號bs-1090R，北京博奧森。DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物公司。PVDF膜（0.22um）品牌pall：廣州譽維生物科技儀器有限公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗動物及分組 將大鼠48只（雄性，體重180～220 g，來源于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）隨機分為兩組，即造模組（顱腦損傷組）和對照組（空白組）各24只，各組再隨機均分為4個小組（n=6）；各小組時間點確定在損傷后2 h、1 d、3 d及7 d（以縫合頭皮結(jié)束開始計時為0時）。實驗過程中不符合實驗要求的大鼠予以相應(yīng)替換。

1.3 大鼠顱腦損傷模型的制作方法 造模組采用Feeney’s自由落體模型制作大鼠顱腦損傷模型（Trauma Brain injure，TBI）。大鼠麻醉成功后固定，在無菌條件下操作，選取左頂部前囟點和人字點中間偏離正中線約3.5 mm處縱形切開頭皮，持牙科鉆去除骨瓣，大小約0.6 cm×0.6 cm，注意勿損傷硬腦膜。安裝自由落體撞擊裝置，撞擊點設(shè)為左側(cè)頂葉皮層，祛碼重量為20 g，撞擊高度為30 cm，撞擊力為600 g·cm，制造中度顱腦損傷模型。撞擊后行傷口及板障止血后縫合頭皮。對照組僅切開頭皮打開骨窗并行傷口板障止血后即縫合頭皮。大鼠處死前行大鼠神經(jīng)運動功能評分。

1.4 標(biāo)本的處理及切片的制備 用3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后打開胸腔，用PBS緩沖液經(jīng)左心室灌注，打開右心耳至留出清亮液體，再用4%多聚甲醛PBS緩沖液10～15 d/min灌注，處死動物并固定60 min后斷頭。在冰盒上快速開顱取腦，切取左側(cè)損傷側(cè)大腦，再以損傷灶為中心冠狀面水平切取左側(cè)大腦為前后兩半，一半行切片免疫組化檢查，另一半行Western Blotting蛋白檢測。行切片免疫組化檢查的受損區(qū)域腦組織用石蠟包埋，然后以冠狀位由損傷皮質(zhì)區(qū)中心向后連續(xù)切片，切片厚約5 μm。另外一半行Western Blotting蛋白檢測的腦組織行受損區(qū)

域腦皮質(zhì)分離，在冰盒上操作，剝離硬腦膜，用小鑷子從切面處將腦皮質(zhì)向外側(cè)分離，完整分離出腦皮質(zhì)，放入凍存管，做好標(biāo)記，保存于-80 ℃液氮瓶里。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片行免疫組化染色，方法為兔超敏二步法，切片用3%的H2O2封閉10 min后，用pH=6.0的枸橘酸溶液加熱孵育15 min行抗原修復(fù)。冷卻至室溫后用5%山羊清室溫封閉20 min。滴加Cdk5一抗4 ℃過夜。PBS清洗后依次滴加試劑1和試劑2室溫孵育20 min。DAB顯色劑顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。Cdk5的表達均以細(xì)胞漿和胞膜內(nèi)側(cè)出現(xiàn)黃色或棕黃色著色為陽性。

1.6 Western Blotting蛋白檢測 蛋白提取試劑盒提取冰凍腦皮質(zhì)組織（約80mg）總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，蛋白濃度定量到每孔60 μg。依次加入5 x上樣緩沖液煮沸（94 ℃，10 min）、上樣（每孔30 μL）、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；Cdk5一抗（比例1：300）4 ℃冰箱孵育過夜16 h，TBST洗膜5 min×5次，滴加山羊抗兔二抗（比例1∶6000），常溫?fù)u床1 h，TBST洗膜5 min×5次，ECL發(fā)光顯色，膠片曝光，掃入凝膠成像系統(tǒng)進行灰度比值分析。

1.7 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 組織切片入新鮮配制的4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS洗3次，5 min/次；入3%過氧化氫溶液甲醇中30 min以封閉內(nèi)源過氧化物酶；入0.1%Triton X-100枸櫞酸鈉緩沖液中冰浴2 min；PBS洗滌3次；加TUNEL反應(yīng)混合液37 ℃反應(yīng)1～1.5 h；PBS沖洗3次；加POD反應(yīng)液37 ℃ 30 min；PBS沖洗3次；DAB顯色5～10 min；蘇木精復(fù)染核，脫水，透明，封片，鏡檢。染色結(jié)果判定：結(jié)果判定以胞核、胞質(zhì)中有棕黃色或者棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。計算神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用（±s）表示，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗（t-test）；雙變量關(guān)聯(lián)性分析采用直線相關(guān)方法分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠顱腦損傷模型結(jié)果的觀察 48只大鼠實驗過程中發(fā)現(xiàn)，除對照組24只外，造模組24只大鼠均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損癥狀體征，表現(xiàn)為不同程度的肢體功能癱瘓，出現(xiàn)意識障礙的有4只。開顱取出大腦后見撞擊點出現(xiàn)腦挫裂傷灶（見圖1）。參照Longa等[8]大鼠神經(jīng)功能缺損評分方法，選取評分為1～3分的動物損傷模型組及參照組。

圖1 大鼠TBI模型的整體觀

2.2 免疫組化染色 損傷側(cè)Cdk5陽性細(xì)胞隨著時間的增加而增多，損傷后2 h、1 d、3 d及7 d時間點各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而對照組各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖2、圖3。

表1 造模組和對照組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)Cdk5的免疫組化實驗iOD值（累計光密度）（x-±s）

2.3 TUNEL法檢測 損傷側(cè)TUNEL陽性細(xì)胞隨著時間的增加而增多，損傷后2 h或1 d與3 d及7 d時間點各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而2 h與1 d兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而對照組各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖4、圖5。

2.4 相關(guān)性統(tǒng)計分析 造模組免疫組化染色及TUNEL檢測結(jié)果的直線相關(guān)性分析顯示：Cdk5的表達水平與細(xì)胞凋亡系數(shù)AI%存在正相關(guān)性，Pearson積距相關(guān)系數(shù)r=0.88，P＜0.05。見圖6。

圖2 造模組和對照組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)Cdk5的免疫組化實驗iOD值比較

2.5 Western blot 定量分析損傷不同時間點Cdk5的表達。隨著時間的增加，造模組的Cdk5表達量增加。見圖7。

表2 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)TUNEL細(xì)胞凋亡AI%

3 討論

圖3 大鼠皮質(zhì)受損區(qū)域Cdk5免疫組化圖

圖4 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)TUNEL細(xì)胞凋亡AI%時序圖

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理情況下，在自身基因調(diào)控下按照自身的程序出現(xiàn)的主動死亡過程，與細(xì)胞壞死不同，由Kerr等[9]在1972年提出。1995年Rink等[10]發(fā)現(xiàn)在顱腦損傷模型大鼠的腦皮質(zhì)等大腦區(qū)域均出現(xiàn)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞，從而證實創(chuàng)傷性腦損傷后存在細(xì)胞凋亡。在TBI后幾小時至數(shù)周內(nèi)，大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體等中樞神經(jīng)系統(tǒng)一般都有神經(jīng)元的丟失和損傷，其中常見的病理改變?yōu)楹藵饪s及皺縮[11]。

圖5 大鼠皮質(zhì)受損區(qū)域TUNEL圖

圖6 造模組Cdk5蛋白的iOD值與細(xì)胞凋亡AI指數(shù)的相關(guān)性線圖

圖7 造模組4個時間點Cdk5的WB結(jié)果

越來越多的實驗證明，Cdk5與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系更加密切，它是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要上游因子[7]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠短暫性腦缺血后，Cdk5活性和P25表達增加與海馬CAl區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。Sakaue等[13]應(yīng)用二甲基汞誘導(dǎo)大鼠小腦顆粒培養(yǎng)細(xì)胞死亡，

證實低濃度二甲基汞可導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增多，使胞內(nèi)calpain激活，將p35裂解成p25，形成P25-Cdk5復(fù)合體，從而使神經(jīng)細(xì)胞凋亡?？梢姡{(diào)控Cdk5活性對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響已成為研究的熱點。

Cdk5特定調(diào)節(jié)因子為分子量為34.8 kD的非周期素蛋白P35，其特異地存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。P35主要存在于大腦皮質(zhì)，并存在于細(xì)胞膜組分中。P35為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，半衰期只有20～30 min，泛素化后被激活的蛋白酶裂解而失活。在興奮性氨基酸及自由基等刺激下，被鈣激活蛋白酶（Calpain）裂解成P25和另一10 kD片段[14]，P25半衰期比P35長5～10倍，具備完全激活Cdk5的功能，且激活能力更強，可造成Cdk5不可調(diào)控性激活[14-15]。顱腦損傷后，被激活的Cdk5可結(jié)合多種細(xì)胞凋亡相關(guān)底物，啟動不同的凋亡途徑，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

本研究表明大鼠皮質(zhì)區(qū)域損傷后，Cdk5的活性表達與神經(jīng)細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)性。通過免疫組化及免疫印跡法筆者觀察到大鼠皮質(zhì)區(qū)域損傷后2 h即有Cdk5表達增加，與此同時通過TUNEL法亦觀察到在2 h組即有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)；隨后從2 h～1 d時間段Cdk5活性及凋亡細(xì)胞的數(shù)量均呈現(xiàn)平緩上升；2 d開始Cdk5表達活性急劇上升，腦細(xì)胞損傷也呈現(xiàn)迅速擴大趨勢，表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞數(shù)量急劇增加，1 d組可稱為腦損傷后的一個“拐點”；其后兩者逐漸上升，于7 d達到觀察范圍內(nèi)的高峰。這與通過時間-量變分析表明Cdk5與凋亡細(xì)胞之間有高度相關(guān)性的研究相符合[16]。結(jié)果提示，顱腦損傷后2 h之前可能是顱腦損傷誘發(fā)各種損傷因子形成初級階段，是引發(fā)進一步腦損傷的重要拐點；因此進一步研究由Cdk5引導(dǎo)的顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡新途徑有可能找到新的治療靶點及有效時間窗。

總之，顱腦損傷后Cdk5與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，為顱腦損傷的臨床治療提供新的實驗依據(jù)。如果能夠?qū)ふ业紺dk5特異性抑制劑，抑制其活性，對于進一步探討Cdk5與細(xì)胞凋亡的關(guān)系和尋找顱腦損傷新的治療方法具有重要的意義。

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10.3969/j.issn.1674-4985.2015.08.006

2014-11-11） （本文編輯：陳丹云）

①廣東省東莞市大嶺山醫(yī)院 廣東 東莞 523819

②廣東醫(yī)學(xué)院

王東軍