黃紅麗施承宏

胸腔積液腺苷脫氨酶檢測(cè)聯(lián)合酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價(jià)值

黃紅麗①施承宏①

目的：研究胸腔積液腺苷脫氨酶（ADA）檢測(cè)聯(lián)合酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（T-SPOT）在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價(jià)值。方法：選取112例結(jié)核性胸膜炎患者作為觀察組，42例非結(jié)核引起的滲出性胸腔積液患者為對(duì)照組，兩組患者均進(jìn)行胸腔積液ADA檢測(cè)及T-SPOT實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：兩組患者胸腔積液檢測(cè)結(jié)果，ADA敏感性87.50%，特異性88.09%；T-SPOT敏感性為89.28%，特異性為92.85%。兩種方法聯(lián)合檢出陽性率為95.54%，與T-SPOT.TB（89.28%）及胸腔積液ADA（87.50%）陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：兩種方法聯(lián)合檢測(cè)可提高結(jié)核性胸膜炎診斷率，對(duì)結(jié)核性胸膜炎診斷提供很好的依據(jù)，是結(jié)核性胸膜炎較好的實(shí)驗(yàn)室診斷手段，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

胸腔積液腺苷脫氨酶； 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)； 結(jié)核性胸膜炎； 診斷

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染性疾病，是單一致病菌所致的傳染性疾病中死亡率最高的疾病，是全球共同關(guān)注的一個(gè)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2011年全世界范圍新增結(jié)核患者870萬例，死于結(jié)核的人數(shù)約140萬[1]。由于結(jié)核菌復(fù)雜的生物學(xué)特性，導(dǎo)致結(jié)核病的診斷較復(fù)雜，易誤診、漏診。世界衛(wèi)生組織2004年的報(bào)告顯示，結(jié)核病的確診率僅37%，即使在發(fā)達(dá)國家也僅有50%的結(jié)核病例通過細(xì)菌學(xué)方法被證實(shí)[2]。結(jié)核性胸膜炎的診斷同樣較為困難。因此尋找一種快速、準(zhǔn)確、可靠的診斷方法十分迫切，可避免誤診、漏診，對(duì)于控制結(jié)核病疫情亦十分重要。為提高結(jié)核性胸膜炎的診斷率，現(xiàn)將本院154例胸腔積液患者作胸腔積液腺苷脫氨酶（ADA）檢測(cè)及酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（T-SPOT）檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2010年1月-2014年3月收治的胸腔積液患者154例為研究對(duì)象。根據(jù)患者的臨床癥狀、胸腔積液常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查及肺部影像學(xué)等檢查診斷的結(jié)核性胸膜炎112例為觀察組，其中男84例，女28例，年齡6～80歲，平均（35.28±14.38）歲。非結(jié)核引起的滲出性胸腔積液42例為對(duì)照組，其中男30例，女12例，年齡11～77歲，平均（49.94±17.14）歲。對(duì)照組中有8例為惡性胸腔積液（6例肺癌，1例白血病，1例胸膜間皮瘤），29例為肺炎引發(fā)的滲出性胸腔積液，1例胸腔積液與肺間質(zhì)纖

維化有關(guān)，1例與自身免疫性溶血有關(guān)，2例為心衰所致，1例為尿毒癥所致。所有患者均經(jīng)組織學(xué)、病理學(xué)活檢確診。兩組患者在性別、年齡等一般資料上比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 ADA儀器、試劑、檢測(cè)方法及結(jié)果判斷 采用奧林巴斯Au5400型全自動(dòng)生化分析儀器，采用寧波美康公司生產(chǎn)的試劑盒，參照試劑盒中提供的方法，用速率法檢測(cè)ADA活性，正常參考值為（14.4±7.1）U/L。具體方法：給予患者常規(guī)胸穿，取大約5 mL胸腔積液，離心之后取清液進(jìn)行送檢。當(dāng)患者的胸腔積液腺苷脫氨酶（ADA）含量大于45 U/L時(shí)，可被確診為結(jié)核性胸膜炎，記為顯性[3-4]。

1.3 T-SPOT.TB儀器、試劑、檢測(cè)方法及結(jié)果判斷 采用海爾Biosafety Cabinet生物安全柜，REVCO CO2孵育箱。T-SPOT.TB試劑盒由上海長(zhǎng)征復(fù)星公司提供。具體檢測(cè)方法：按照試劑盒說明書采集外周靜脈血4 mL，肝素抗凝，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），用細(xì)胞培養(yǎng)基AIMV 重懸細(xì)胞，并將濃度調(diào)整至2.5×106/mL。在已包被抗IFNγ單抗的96孔板上，分別加入50 μL細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，50 μL植物血凝素作為陽性對(duì)照，以50 μL結(jié)核分枝桿菌特異性ESAT-6和CFP-10作為刺激原。然后在每個(gè)孔中加入100 μL上述細(xì)胞懸液。把96孔板放在37 ℃孵箱培養(yǎng)16～20 h后， 用PBS液洗板4次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，在2～8 ℃下孵育1 h。孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入顯色底物BCIP/NBTPLUS， 室溫中靜置7 min后蒸餾水終止反應(yīng)。陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＜5個(gè)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6；（2）如果空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)必須＞2倍的空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)[2]。

1.4 治療 112例結(jié)核性胸膜炎患者均給予規(guī)范抗結(jié)核藥物治療，即口服“異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇”片（具體用量根據(jù)患者體重按照藥品說明書中要求給予）強(qiáng)化治療2～3個(gè)月后，再繼續(xù)口服“異煙肼、利福平”片鞏固治療至9～12個(gè)月。大量胸腔積液患者在抗結(jié)核治療的同時(shí)給于加用糖皮質(zhì)激素（強(qiáng)的松片）后，逐漸減量至停用。所有患者全身癥狀消失，血沉正常，胸腔積液逐漸吸收，病情穩(wěn)定后出院，給予門診督導(dǎo)化療，隨訪病情無反復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，多個(gè)樣本率的比較采用 χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADA檢測(cè)不同性質(zhì)胸腔積液敏感性及特異性比較 ADA檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的敏感性為87.50%，特異性為88.09%。見表1。

表1 ADA檢測(cè)不同性質(zhì)胸腔積液敏感性及特異性比較

2.2 T-SPOT.TB檢測(cè)不同性質(zhì)胸腔積液敏感性及特異性比較 T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎的敏感性為89.28%，特異性為92.85%。見表2。

表2 T-SPOT.TB檢測(cè)不同性質(zhì)胸腔積液敏感性及特異性比較 例（%）

2.3 112例結(jié)核性胸膜炎胸腔積液ADA檢測(cè)聯(lián)合T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率為95.54%。見表3。與胸腔積液ADA（87.50%）及T-SPOT.TB（89.28%）陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 112例結(jié)核性胸膜炎胸腔積液ADA檢測(cè)聯(lián)合T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果 例

3 討論

胸腔積液病因較復(fù)雜，腫瘤、炎癥、結(jié)核等均可導(dǎo)致患者出現(xiàn)胸腔積液，結(jié)核性胸膜炎是國內(nèi)非惡性胸腔積液最常見的病因。目前主要是依據(jù)患者的臨床癥狀，給予胸腔穿刺，行胸腔積液常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查，再結(jié)合肺部影像學(xué)、結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核抗體等檢查來診斷結(jié)核性胸膜炎，隨后給予診斷性抗結(jié)核治療，再根據(jù)療效來印證診斷的正確性，有時(shí)難免會(huì)出現(xiàn)誤診、漏診。診斷結(jié)核性胸膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)是胸腔積液中找到抗酸桿菌，但胸腔積液涂片找抗酸桿菌的陽性率低，僅7%～13%[5-6]。雖然胸膜病理組織學(xué)活檢的陽性率較高，可達(dá)50%～80%，經(jīng)胸腔鏡診斷陽性率可高達(dá)86%～97%，但這些都是有創(chuàng)性檢查，不可能常規(guī)應(yīng)用于臨床實(shí)踐[7]。而胸膜活檢、內(nèi)科胸腔鏡創(chuàng)傷性大，存在一定危險(xiǎn)，不容易被患者所接受，且受醫(yī)院條件制約，不易廣泛推廣。

胸腔積液腺苷脫氨酶（ADA）檢測(cè)是目前常用于診斷結(jié)核性胸膜炎的實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目之一。腺苷脫氨酶是前T淋巴細(xì)胞分化淋巴細(xì)胞過程中不可缺少的酶，體內(nèi)分布廣泛，ADA活性與淋巴細(xì)胞的激活和分化有關(guān)，ADA的增高考慮存在細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)核性胸膜炎因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌對(duì)單核巨噬系統(tǒng)起到了激活作用，顯著增多了淋巴細(xì)胞，在人體組織中，含有較多腺苷脫氨酶的細(xì)胞和組織主要有淋巴細(xì)胞與肺組織[4]。結(jié)核引起的細(xì)胞免疫由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，腺苷脫氨酶不斷釋放入血，因此腺苷脫氨酶在胸腔積液的含量比較高。結(jié)核性胸腔積液中ADA含量明顯高于惡性胸腔積液[8-9]。測(cè)定胸水中ADA活性不僅對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷具有重要意義，而且對(duì)滲出液的鑒別診斷具有非常重要的參考價(jià)值[10]。本文結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液ADA敏感性87.50%，特異性88.09%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]。腺苷脫氨酶用于結(jié)核性胸膜炎的早期診斷具有重要的價(jià)值，能夠提高診斷的特異性，目前已被廣泛應(yīng)用。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)是一種新型的免疫學(xué)技術(shù)，從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子細(xì)胞，由ELISPOT發(fā)展而來的T-SPOT.TB技術(shù)用于檢測(cè)結(jié)核感染后特異性T細(xì)胞分泌的90%以上，且r干擾素對(duì)結(jié)核的特異性和敏感性均非常高；T-SPOT.TB檢測(cè)只與外周血液中結(jié)核特異抗原刺激產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞有關(guān)，與感染部位無關(guān)，采血簡(jiǎn)便易行，實(shí)驗(yàn)室血液檢查2 d可得到檢驗(yàn)結(jié)果，可使患者得到早期診斷與及時(shí)治療。因肺外結(jié)核不容易得到細(xì)菌學(xué)證據(jù)，T-SPOT.TB檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)亦加明顯。

2008年P(guān)ai等[12]對(duì)T細(xì)胞IFN-r釋放試驗(yàn)的應(yīng)用研究進(jìn)行了綜述， T-SPOT.TB總的敏感性為90%（86%～93%），總特異性為93%（86%～100%）?；舴品频萚11]對(duì)肺外結(jié)核的研究結(jié)果提示T-SPOT.TB對(duì)肺外結(jié)核診斷的敏感性為93.5%。杜巖清等[14]對(duì)結(jié)核性胸膜炎的研究結(jié)果提示T-SPOT.TB在結(jié)核性胸膜炎的診斷中敏感性91.9%，特異性90.6%，診斷準(zhǔn)確率91.3%。本組研究提示其敏感性為89.28%，特異性為92.85%，與國內(nèi)外報(bào)道相當(dāng)。T-SPOT.TB是結(jié)核性胸膜炎良好的實(shí)驗(yàn)室診斷手段。

ADA等單項(xiàng)指標(biāo)用于鑒別診斷時(shí)都存在假陽性和假陰性，只分析一個(gè)指標(biāo)是不足于有效鑒別胸腔積液的性質(zhì)[15]，而聯(lián)合檢測(cè)可以提高胸腔積液性質(zhì)的確診率。本組資料顯示：胸腔積液ADA聯(lián)合T-SPOT.TB檢查陽性率（95.54%）與T-SPOT.TB（89.28%）及胸腔積液ADA（87.50%）陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，T-SPOT.TB技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，有較高的敏感性和特異性，胸腔積液ADA也具有較高的敏感性和特異性，兩種方法聯(lián)合檢測(cè)可提高結(jié)核性胸膜炎診斷率，能為結(jié)核性胸膜炎的診斷提供很好的依據(jù)，是結(jié)核性胸膜炎較好的實(shí)驗(yàn)室診斷手段，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

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The Value of Adenosine Deaminase from Pleural Effusions and T-SPOT in Diagnosis of Tuberculous Pleurisy/

HUANG Hong-li，SHI Cheng-hong.//Medical Innovation of China，2015，12（08）：010-012

Objective：To study the value of adenosine deaminase from pleural effusions and T-SPOT in diagnosis of tuberculous pleurisy.Method：Selected 112 cases of tuberculous patients as the observation group，42 cases of patiens with non-tuberculous exudative pleural effusion to the control group， two groups of patients were detected both ADA and T-Spot.Result：Two groups of patients with Pleural effusion test results，the sensitivity of ADA and T-Spot were 87.50% and 89.28%，respectively.The specificity of ADA and T-Spot were 88.09% and 92.85%.Combination of two methods of detection positive rate was 95.54%.Two detection methods there was statistically different （P＜0.05）. Conclusion：Combination of two methods can improve the positive rate，the diagnosis of tuberculous pleurisy provide a good basis，a better laboratory diagnostic tool，has a high value and broad application prospects.

ADA； T-Spot； Tuberculous pleuritis； Diagnosis

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.08.004

2014-10-21） （本文編輯：陳丹云）

①昆明市第三人民醫(yī)院 云南 昆明 650041

黃紅麗

First-author’s address：The Third People’s Hospital in Kunming， Kunming 650041，China