鐘潔霞

泮托拉唑聯(lián)合楓蓼腸胃康膠囊對乙醇損傷的人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用

鐘潔霞①

目的：觀察泮托拉唑聯(lián)合楓蓼腸胃康膠囊對乙醇損傷的人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用。方法：用不同濃度的乙醇孵育體外培養(yǎng)的人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞，于不同的時(shí)間段中觀察以建立穩(wěn)定的胃黏膜損傷模型，將泮托拉唑、楓蓼腸胃康膠囊分別配制成不同濃度，MTT法觀察兩藥單獨(dú)及聯(lián)用對GES-1細(xì)胞的干預(yù)。結(jié)果：人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞在7%的乙醇中孵育3 h細(xì)胞抑制率達(dá)到40%，是最佳的胃黏膜損傷細(xì)胞模型。對GES-1細(xì)胞的保護(hù)，各濃度泮托拉唑和楓蓼腸胃康膠囊均有一定作用，最佳濃度分別為60 μg/mL和200 μg/mL，兩藥聯(lián)用后能夠減少藥物劑量，且可以提高對胃黏膜的保護(hù)作用。結(jié)論：泮托拉唑與楓蓼腸胃康膠囊聯(lián)用后可以提高用藥安全，減少用藥劑量，在低劑量下即可保護(hù)損傷的人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞，臨床上值得推廣。

泮托拉唑； 楓蓼腸胃康膠囊； 人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞； 保護(hù)

近年來，由于人們飲食、生活越來越?jīng)]規(guī)律，尤其是過量乙醇的攝入，導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍發(fā)病率不斷升高，成了臨床最常見的疾病之一，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1]。泮托拉唑是第三代質(zhì)子泵抑制劑（PPI），由于其療效顯著，在臨床上廣泛應(yīng)用于急性胃黏膜病變、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病的治療，但與此同時(shí)，其不良反應(yīng)亦逐漸增多[2]。相關(guān)研究報(bào)道，泮托拉唑主要不良反應(yīng)為腹瀉、惡心、嘔吐、消化不良，甚至存在肌病、血液病、腎病等病例，不良反應(yīng)與藥物劑量存在關(guān)系，尤其是對于肝腎功能不全的患者[3]。楓蓼腸胃康由牛耳楓和辣蓼兩種藥物經(jīng)過現(xiàn)代工藝提取精制而成，兩者配伍升降復(fù)常、苦辛并進(jìn)、寒溫并用，使胃腸得和，具有除濕化滯、理氣健胃等功效[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明該藥能夠在胃腸發(fā)揮解痙抗炎的作用，有效緩解急慢性胃腸炎癥狀[5]。筆者通過本研究觀察泮托拉唑聯(lián)合楓蓼腸胃康膠囊對乙醇損傷的人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞（簡稱GES-1細(xì)胞）的保護(hù)作用，從細(xì)胞層面上揭示中西藥聯(lián)用對胃黏膜保護(hù)可能的機(jī)制[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 GES-1細(xì)胞由上海信裕生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑 泮托拉唑（商品名：泮立蘇，40 mg/片，杭州中美華東制藥有限公司，生產(chǎn)批號：140513；楓蓼腸胃康膠囊（0.37 g/粒，?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰荆a(chǎn)批號：131005）；超敏發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；PVDF膜（深圳泰能新材料有限公司）；MTT（廣州朗日生物技術(shù)有限公司）；培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶等（臺(tái)州市黃巖方野科技發(fā)展有限公司）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基（武漢博士德生物工程有限公司）；其他試劑為市售分析純。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)分析儀（上海閃譜生物科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（東莞鵬馳凈化科技有限公司）；XDS-1B倒置生物顯微鏡（北京冠普佳科技有限公司）；GL-16G-II型高速冷凍離心機(jī)（上海雙旭電子有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 GES-1細(xì)胞的培養(yǎng) 于標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱中用DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 mL/L胎牛血清）常規(guī)培養(yǎng)GES-1細(xì)胞株2～3 d，約90%滿瓶時(shí)傳代。

1.4.2 GES-1細(xì)胞損傷模型的建立 將GES-1細(xì)胞用含乙醇的培養(yǎng)液（濃度4%～8%）作用2～5 h，造成GES-1細(xì)胞損傷，運(yùn)用MTT法進(jìn)行檢測，結(jié)果最佳細(xì)胞模型為細(xì)胞抑制率40%左右。

1.4.3 細(xì)胞的分組和處理 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為泮托拉唑組、楓蓼腸胃康膠囊組、泮托拉唑聯(lián)合楓蓼腸胃康膠囊組（聯(lián)合用藥組）、正常組。處理步驟如下：（1）調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/mL，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種入96孔板（按照每孔100 uL），常規(guī)放置5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后，吸取上清液，運(yùn)用PBS洗2次。（2）將完全培養(yǎng)基加入正常組GES-1細(xì)胞，將篩選出的乙醇濃度加入其余各組，孵育一定時(shí)間后，吸取上清液，運(yùn)用PBS洗2次。（3）于含不同濃度的藥物培養(yǎng)基100 μL中加入泮托拉唑組、楓蓼腸胃康膠囊組、聯(lián)合用藥組GES-1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.4 細(xì)胞活性的檢測 正常組加完全培養(yǎng)基100 μL，泮托拉唑組和楓蓼腸胃康膠囊組分別換上100 μL含不同濃度的泮托拉唑（0、10、20、30、40、50、60、80、100 μg/mL）和楓蓼腸胃康膠囊（0、40、80、120、160、200、240、280、320 μg/mL）的培養(yǎng)液，聯(lián)合用藥組換上100 μL按上述濃度配制的兩藥聯(lián)用培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。各組在培養(yǎng)24 h后，分別加入10 μL 5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)液，加入100μL DMSO于每個(gè)復(fù)孔中，振蕩10 min使之溶解。運(yùn)用MTT比色法，用酶標(biāo)儀以490 nm為測定波長檢測吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 16.0，兩組比較采用SNK法，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長情況 正常GES-1細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞之間連接緊密，生長旺盛，中央有圓形核，貼壁呈多邊形或菱形等不規(guī)則形狀生長。乙醇損傷后，大量細(xì)胞漂浮于細(xì)胞液中，只有少許細(xì)胞貼壁，細(xì)胞間隙隨著乙醇濃度提高或損傷時(shí)間增加而變大，連接減少，甚至出現(xiàn)細(xì)胞片狀脫落，細(xì)胞呈橢圓形或圓形狀，可見空泡變性，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核固縮，死亡細(xì)胞逐漸增多。

2.2 乙醇致GES-1細(xì)胞損傷模型的建立 在各個(gè)不同的時(shí)間段，各種濃度的乙醇均對細(xì)胞有損傷，其中細(xì)胞抑制率達(dá)到40%是運(yùn)用7%的乙醇孵育3 h，表明該模型是細(xì)胞損傷的最佳模型，如圖1所示。

圖1 不同孵育時(shí)間和不同濃度乙醇對GES-1細(xì)胞的抑制率

2.3 各組細(xì)胞活性 MTT法顯示，泮托拉唑組中，細(xì)胞增殖在濃度為0～60 μg/mL時(shí)呈劑量依賴性，增值活性在80～100 μg/mL仍存在，但效果不如60 μg/mL時(shí)明顯，與其他濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這可能是泮托拉唑劑量過高對細(xì)胞產(chǎn)生不良反應(yīng)，如表1所示。楓蓼腸胃康膠囊組中，細(xì)胞增殖在濃度為200 μg/mL的時(shí)候最顯著，與其他濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但細(xì)胞增殖開始減弱于劑量高于200 μg/mL時(shí)，可能是由于藥物毒性的作用，見表2。聯(lián)合用藥組細(xì)胞與相應(yīng)濃度的泮托拉唑組和楓蓼腸胃康膠囊組相比，活性均高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

3 討論

GES-1細(xì)胞來源于胎兒胃黏膜上皮，具有正常人體胃黏膜上皮細(xì)胞多種特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用該細(xì)胞作為細(xì)胞模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，在分子水平上接近臨床實(shí)驗(yàn)[7]。實(shí)驗(yàn)采用乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍模型潰瘍發(fā)生率高，不用手術(shù)，方法簡單，結(jié)果可靠[8]。本實(shí)驗(yàn)MTT法顯示細(xì)胞抑制率達(dá)40%在7%的乙醇孵育3 h的條件下

實(shí)現(xiàn)，成功造成胃黏膜細(xì)胞損傷模型[9]。

表1 不同濃度泮托拉唑與正常組細(xì)胞OD值（±s，n=5）

表1 不同濃度泮托拉唑與正常組細(xì)胞OD值（±s，n=5）

*與本組其他濃度比較，P＜0.05

組別OD值正常組1.141±0.111泮托拉唑組0 μg/mL0.641±0.09 10 μg/mL0.759±0.05 20 μg/mL0.778±0.04 30 μg/mL0.851±0.20 40 μg/mL0.881±0.06 50 μg/mL0.971±0.05 60 μg/mL 1.068±0.08*80 μg/mL0.987±0.03 100 μg/mL0.974±0.12

表2 不同濃度楓蓼腸胃康膠囊與正常組細(xì)胞OD值（±s，n=5）

表2 不同濃度楓蓼腸胃康膠囊與正常組細(xì)胞OD值（±s，n=5）

*與本組其他濃度比較，P＜0.05

組別OD值正常組1.141±0.111楓蓼腸胃康膠囊組0 μg/mL0.658±0.059 40 μg/mL0.731±0.063 80 μg/mL0.771±0.091 120 μg/mL0.921±0.051 160 μg/mL0.952±0.069 200 μg/mL 0.969±0.074*240 μg/mL0.931±0.029 280 μg/mL0.874±0.059 320 μg/mL0.837±0.079

表3 不同濃度聯(lián)合用藥與正常組細(xì)胞OD值（±s，n=5）

表3 不同濃度聯(lián)合用藥與正常組細(xì)胞OD值（±s，n=5）

*與表1、2中泮托拉唑組和楓蓼腸胃康膠囊組對應(yīng)濃度比較，P＜0.01

組別OD值正常組1.141±0.111泮托拉唑組聯(lián)合楓蓼腸胃康膠囊組0+0（μg/mL）0.675±0.064 10+40（μg/mL） 0.831±0.061*20+80（μg/mL） 0.911±0.072*30+120（μg/mL） 0.952±0.731*40+160（μg/mL） 1.043±0.081*50+200（μg/mL） 1.004±0.105*60+240（μg/mL） 0.891±0.044*80+280（μg/mL） 0.861±0.059*100+320（μg/mL） 0.841±0.043*

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，楓蓼腸胃康膠囊具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛雙重作用，可迅速緩解腹瀉、腹痛、腹脹等臨床癥狀，是治療胃腸道疾病的有效中成藥制劑[10]。泮托拉唑在臨床應(yīng)用上有著其他藥不可替代的特點(diǎn)，療效顯著，但隨著該藥的廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)也不斷增多，其不良反應(yīng)涉及包括循環(huán)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等在內(nèi)的多個(gè)器官系統(tǒng)[11-15]。所以，加強(qiáng)對泮托拉唑應(yīng)用療程及劑量等研究，輔以中藥、中成藥聯(lián)用，減少和避免不良反應(yīng)的發(fā)生，具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)將胃潰瘍模型的GES-1細(xì)胞利用泮托拉唑和楓蓼腸胃康膠囊單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用作用，結(jié)果表明兩組藥物均有促進(jìn)增殖的作用，但隨著藥物劑量的遞增，達(dá)到一定程度后對細(xì)胞的增殖呈抑制作用。聯(lián)合用藥可以產(chǎn)生協(xié)同作用，在減少用藥劑量的情況下達(dá)到相同的效果，達(dá)到減量而增效，保證用藥安全。

由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本實(shí)驗(yàn)無法對胃黏膜bFGF蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，對中西藥聯(lián)用保護(hù)胃黏膜細(xì)胞的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Protection of Pantoprazole with Fengliao Changweikang Capsule on Ethanol Damage Human Gastric Epithelial GES-1 Cells Injured by Ethanol/

ZHONG J ie-xia.//Medical Innovation of China，2015，12（08）：004-006

Objective：To Observe the protective effect of pantoprazole capsules with fengliao changweikang on human gastric epithelial GES-1 cells injured ethanol. Method： Human gastric epithelial GES-1 cells were cultured in vitro，incubated with different concentrations of ethanol，and observed at different time periods in order to establish a stable gastric mucosal injury model. Pantoprazole and fengliao changweikang capsules were formulated into different concentrations， MTT were used to observe the GES-1 cells intervention by two drugs alone and in combination.Result：Incubated at 7% ethanol for 3 h， human gastric epithelial GES-1 cells inhibition rate reached 40%， and this was the best model of injured gastric mucosal cell.Each concentration of pantoprazole and fengliao changweikang capsules had a protective effect on the GES-1 cells， the optimum concentration of both drugs were 60 μg/mL and 200 μg/mL， in combination with two drugs could reduce the dose and enhance the protective effect of the gastric mucosa. Conclusion：Combining with pantoprazole and fengliao changweikang capsules can improve medication safety， reduce the dosage， protect human gastric epithelial damage GES-1 cells at low doses，and they are worth promoting in clinical.

Pantoprazole； Fengliao changweikang capsule； Human gastric epithelial GES-1 cells；Protection

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.08.002

2014-11-12） （本文編輯：周亞杰）

①廣東省江門市人民醫(yī)院 廣東 江門 529000

鐘潔霞

First-author’s address：The People’s Hospital of J iangmen，J iangmen 529000，China