楊振泉,貢湘磊，葉平,徐同林，高璐,顧瑞霞

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127；2.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225127；3.泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,江蘇泰州 225309）

0 引言

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）具有平衡腸道菌群、調(diào)節(jié)免疫功能等生理功效，是目前研究最為深入的乳酸菌之一[1,2]。發(fā)酵乳是活性益生菌的主要載體，研究顯示添加鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的牛乳能夠產(chǎn)生抑菌、降血壓、抗突變等多種活性因子[3，4]。建立快速特異的鼠李糖乳桿菌計(jì)數(shù)方法對(duì)于評(píng)價(jià)發(fā)酵乳中有效活菌數(shù)、研究發(fā)酵和貯藏過(guò)程中活菌變化規(guī)律具有重要意義[5]。相比現(xiàn)有的益生菌計(jì)數(shù)方法[6-9]，菌落免疫印跡技術(shù)（Colony immunoblotting，CIB）更加快速、廉價(jià)，適合復(fù)雜生態(tài)體系中細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)[10，11]，但該法在鼠李糖乳桿菌選擇性計(jì)數(shù)方面國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。菌毛蛋白（FimI）是高粘附性鼠李糖乳桿菌表面特有的標(biāo)志物[12],本文應(yīng)用重組FimI抗體（anti-rFimI）建立了鼠李糖乳桿菌CIB計(jì)數(shù)方法，并對(duì)長(zhǎng)壽人群來(lái)源的鼠李糖乳桿菌grx19（CGMCC No.5519）[13]在多菌株發(fā)酵乳體系中的生長(zhǎng)與存活特征進(jìn)行研究，旨在為鼠李糖乳桿菌grx19發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供新的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

鼠李糖乳桿菌grx19（Lactobacillus rhamnosus grx19，CGMCC No.5519）菌株；保加利亞乳桿菌LB（Lactobacillus bulgaricus，LB）和嗜熱鏈球菌ST（Streptococcus thermophilus，ST）均分離自商品化酸奶發(fā)酵劑；重組鼠李糖乳桿菌鞭毛亞基多克隆抗體（anti-rFimI）由本室制備；MRS培養(yǎng)基；PCR試劑、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG以及細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增引物8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 15R：5'-AAGGAG GTGATCCAGCCGCA-3'，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 發(fā)酵劑的制備

將菌株grx19、LB和ST凍干菌粉接種5 mL MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，取培養(yǎng)物以5%（V/V）接種量接種MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，4℃離心收集菌體（4 000 g，10 min），用PBS緩沖液懸浮菌體，并調(diào)整OD600nm=0.5，菌株grx19、LB和ST按不同體積比混合，制備菌懸液Amix（0∶1∶1）、Bmix（0.01∶1∶1）、Cmix（0.1∶1∶1）、Dmix（1∶1∶1）、Emix（10∶1∶1），所制得的混合菌懸液置4℃保藏備用。

1.3 菌落免疫印跡

將單菌株及混合菌株懸液用PBS緩沖液梯度稀釋?zhuān)x取3個(gè)適當(dāng)?shù)南♂尪冗M(jìn)行MRS平板涂布，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并選擇分離良好的平板用于菌落免疫印跡測(cè)定。剪取與培養(yǎng)皿內(nèi)徑大小相同的硝酸纖維素（NC）膜，在去離子水中浸泡10 min，37℃干燥10 min。將NC膜置于培養(yǎng)基表面，使膜與培養(yǎng)基表面充分接觸，室溫靜置5 min后取下NC膜，37℃干燥30 min；將轉(zhuǎn)印膜放置在5%的脫脂乳中，室溫封閉1 h；PBST緩沖液洗滌3次，置于anti-rFimI抗體稀釋液中（稀釋度為1∶2000）室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，置于HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1 000稀釋?zhuān)┲蟹跤? h；PBST洗滌3次，將轉(zhuǎn)印膜浸入新鮮配制的DAB顯色液中，避光顯色10 min，待膜上出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)，用去離子水漂洗2次終止反應(yīng)，將膜置于干凈濾紙上自然干燥，分析陽(yáng)性斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的菌落及數(shù)量。

1.4 陽(yáng)性菌落確證

挑取陽(yáng)性斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)的菌落，接種MRS液體培養(yǎng)基，按文獻(xiàn)[14]所述的CTAB方法提取基因組DNA；以基因組DNA為模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2 μL模板（50 ng/μL）、4 μL dNTPs（25 mmol/μL）、引物8F（10 pmol/μL）和15R（10 pmol/ μL）各1.5 μL、10×Buffer 5 μL、MgCl2（25 mmol/L）5 μL、Tag酶（5 U/ μL）0.3 μL、加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物委托上海生物工程有限公司測(cè)序，所得結(jié)果在基因庫(kù)GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行Blasten比對(duì)，序列同源性大于99%設(shè)為相同種。

1.5 發(fā)酵乳樣品制備

將12%的脫脂復(fù)原乳95℃殺菌5 min，冷卻至42℃，分成A、B、C、D 4個(gè)接種組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，LB和ST均按體積分?jǐn)?shù)為1.0%接種；grx19分別按0%（A組），0.1%（B組），1%（C組）和10%（D組）接種；接種物于42℃培養(yǎng)9 h，在第0，3，6和9小時(shí)取樣測(cè)定grx19和LB+ST活菌數(shù)以及pH值。制備好的發(fā)酵乳樣品置4 ℃貯藏28 d，在第1，7，14，21 d和28 d取樣測(cè)定grx19及LB+ST活菌數(shù)。

1.6 pH測(cè)定

將發(fā)酵乳樣品溫度調(diào)節(jié)至20℃，采用數(shù)顯式pH計(jì)測(cè)量。

1.7 活菌數(shù)測(cè)定

總活菌數(shù)檢測(cè)按文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行，將發(fā)酵乳樣品采用生理鹽水梯度稀釋?zhuān)x取3個(gè)適當(dāng)?shù)南♂尪冗M(jìn)行MRS平板涂布，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；鼠李糖乳桿菌grx19活菌通過(guò)菌落免疫印跡法計(jì)數(shù)，試驗(yàn)方法同1.3所述；LB+ST活菌數(shù)根據(jù)免疫印跡試驗(yàn)中的陰性菌落數(shù)計(jì)算，取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值表示活菌數(shù)（單位：mL-1）。

1.8 統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果取3次試驗(yàn)的的平均值，組間差異采用Sigmaplot 10.0軟件中的t檢驗(yàn)?zāi)Ｊ竭M(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 鼠李糖乳桿菌grx19 CIB檢測(cè)方法建立

將菌株grx19、LB和ST的混合菌懸液，梯度稀釋后涂布MRS平板,厭氧培養(yǎng)48 h形成的菌落通過(guò)轉(zhuǎn)印和CIB處理后，grx19菌落在NC膜上形成清晰的菌落印跡，而LB和ST則不能形成印跡（如圖1所示）。16S rDNA測(cè)序鑒定結(jié)果證實(shí)所有陽(yáng)性菌落（圖1中箭頭所示）均為鼠李糖乳桿菌（序列同源性大于99%），結(jié)果表明應(yīng)用鼠李糖乳桿菌菌毛抗體anti-rFimI（稀釋度1∶2 000）作為檢測(cè)抗體，所建立的菌落免疫印跡法能夠特異性的檢測(cè)MRS分離平板上的鼠李糖乳桿菌菌落。

圖1 鼠李糖乳桿菌grx19菌落免疫印跡檢測(cè)方法的建立

2.2 混合菌懸液中鼠李糖乳桿菌grx19的CIB計(jì)數(shù)結(jié)果

以不同比例混合的grx19、LB和ST菌懸液作為模擬樣品，應(yīng)用MRS平板分離結(jié)合CIB對(duì)其中的grx19以及LB+ST活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如表1所示。表中數(shù)據(jù)顯示grx19單菌株懸液形成的CIB菌落陽(yáng)性率為100%，而LB、ST以及Amix等不含grx19的菌懸液形成的陽(yáng)性菌落均為0，菌懸液Bmix、Cmix、Dmix和Emix中陽(yáng)性菌落比例分別為0.5%，3.3%，35.1%和84.4%；與預(yù)設(shè)的grx19比例（0.6%，5.8%，38.1%和86.0%）基本一致（R2=0.998）。隨機(jī)挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定，結(jié)果100%為鼠李糖乳桿菌。結(jié)果表明所建立的計(jì)數(shù)方法能夠反應(yīng)混合菌株樣品中的grx19的活菌數(shù)量變化。

表1 菌落免疫印跡法對(duì)不同菌懸液中g(shù)rx19活菌數(shù)的測(cè)定結(jié)果

2.3 發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)變化

應(yīng)用MRS平板計(jì)數(shù)結(jié)合CIB方法對(duì)接種不同濃度grx19、LB和ST發(fā)酵乳中的活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。發(fā)酵過(guò)程中，LB+ST總活菌數(shù)均呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，A、B、C、D四個(gè)接種組LB+ST活菌濃度分別由1.4×107mL-1上升到4.3×108～6.9×108mL-1，而grx19在B組（0.1%接種）中活菌數(shù)由0.7×106mL-1上升到3.6×106mL-1，D組（10%接種量）中的grx19活菌數(shù)由7×107mL-1上升到2.2×108mL-1，均顯示了較慢的生長(zhǎng)速度。鼠李糖乳桿菌grx19的起始接種濃度對(duì)發(fā)酵乳中LB+ST增殖具有一定影響，A組和B組在4個(gè)取樣點(diǎn)LB+ST活菌數(shù)變化沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），表明低接種量grx19（B組）對(duì)LB+ST生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響；中等接種量grx19（C組）在發(fā)酵6 h對(duì)LB+ST增殖具有一定促進(jìn)作用；在高接種量grx19（D組）中，在0～3 h顯示了促進(jìn)效應(yīng)，但在6 h后對(duì)LB+ST的增殖顯示了一定的抑制效應(yīng)。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中g(shù)rx19和LB+ST活菌數(shù)變化

2.4 發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化

在發(fā)酵過(guò)程中，不同接種組的pH值變化趨勢(shì)如圖3所示，由圖3可知發(fā)酵過(guò)程中乳的pH值呈不斷下降趨勢(shì)，不同接種物起始pH在6.3至6.5之間，發(fā)酵終點(diǎn)pH值在4.3至4.6之間，發(fā)酵3～6 h內(nèi)pH值下降最為迅速，但接種組A、B、C、D之間的pH變化沒(méi)有顯著差異，結(jié)果表明接種grx19菌株后沒(méi)有顯著影響凝乳和產(chǎn)酸。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中pH值變化

2.5 4℃冷藏過(guò)程中活菌數(shù)變化

應(yīng)用MRS平板計(jì)數(shù)結(jié)合菌落免疫印跡方法對(duì)不同發(fā)酵乳在4℃冷藏過(guò)程中的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在整個(gè)冷藏期內(nèi)，發(fā)酵乳L(zhǎng)B+ST活菌濃度在冷藏7 d后均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。A（LB+ST）、B（LB+ST+0.1%grx19）、C（LB+ST+1%grx19）、D（LB+ST+10%grx19）四個(gè)接種組的LB+ST活菌數(shù)下降值分別為4.83×108，4.62×108，6.36×108和4.47×108mL-1，第28 d存活率分別為7.8%，16.3%，8.7%和7.2%；grx19活菌數(shù)在冷藏14 d后呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)，B、C、D接種組中g(shù)rx19活菌下降值分別5.05×106，3.12×107，1.69×108mL-1，第28 d存活率分別為31.6%，30.2%，32.2%，顯著高于LB+ST存活率（P＜0.01），表明grx19耐低溫冷藏能力顯著高于LB和ST。

3 結(jié)論

（1）應(yīng)用鼠李糖乳桿菌菌毛蛋白亞基FimI抗體建立的菌落免疫印跡方法，具有高度選擇性和特異性，方法簡(jiǎn)便快速，能夠用于檢測(cè)多菌株發(fā)酵乳中鼠李糖乳桿菌的活菌動(dòng)態(tài)變化，可為鼠李糖乳桿菌產(chǎn)品質(zhì)量控制和活菌計(jì)數(shù)提供新方法。

圖4 4℃冷藏過(guò)程中g(shù)rx19和LB+ST活菌數(shù)變化

（2）鼠李糖乳桿菌grx19（CGMCC No.5519）在發(fā)酵過(guò)程中增殖速度慢于常規(guī)發(fā)酵劑菌株，在發(fā)酵乳中添加（0.7-7）×106mL-1grx19，在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)發(fā)酵劑菌株嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸影響不大，但高接種量的grx19（7×107mL-1）在發(fā)酵后期對(duì)發(fā)酵劑菌株生長(zhǎng)有一定抑制效應(yīng)。

（3）發(fā)酵乳中的鼠李糖乳桿菌grx19在4℃冷藏28 d后存活率保持在30%左右，耐低溫冷藏能力顯著高于常規(guī)發(fā)酵劑菌株LB和ST，表明該菌株可用于生產(chǎn)長(zhǎng)貨架期的活菌型乳酸菌飲料及發(fā)酵乳制品。

[1]LEBEER S,CLAES I,TYTGAT H L P,et al.Functional analysis of Lactobacillus rhamnosus GG pili in relation to adhesion and immunomodulatory interactions with intestinal epithelial cells[J].Appl Environ Microbiol,2012,78：185-193.

[2]TUO Y,ZHANG W,ZHANG L,et al.Study of probiotic potential of four wild Lactobacillus rhamnosus strains[J].Anaerobe,2013,21：22-27.

[3]楊紅梅,林漢亮.鼠李糖乳桿菌在酸奶中的應(yīng)用研究[J].新疆畜牧業(yè),2011,10：30-32.

[4]田豐偉,丁納,趙建新,等.鼠李糖乳桿菌YHOC137及其發(fā)酵乳的體外抗致突變作用[J].食品工業(yè)科技,2008,29（4）：71-74.

[5]TRIPATHI M K,GIRI S K.Probiotic functional foods：Survival of probiotics during processing and storage[J].J.Funct Foods,2014,9：225-24.

[6]包秋華，張家超，李梅花,等.一種快速定性和定量檢測(cè)發(fā)酵乳中L.rhamnosus的方法[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2010,5：225-227.

[7]ACHILLEOS C,BERTHIER F.Quantitative PCR for the specific quantification of Lactococcus lactis and Lactobacillus paracasei and its interest for Lactococcus lactis in cheese samples[J].Food Microbiol,2013,36：286-295.

[8]SAKAI T,OISHI K,ASAHARA T,et al.M-RTLV agar,a novel selective medium to distinguish Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei from Lactobacillus rhamnosus[J].Int J Food Microbiol,2010,139：154-160.

[9]LENA M D,QUERO G M,SANTOVITO E,et al.A selective medium for isolation and accurate enumeration of Lactobacillus casei-group lactobacilli in probiotic milks and dairy products[J].Int Dairy J,2015,47：27-36.

[10]DUEZ H,PELLETIER C,COOLS S,et al.A colony immunoblotting method for quantitative detection of a Bifidobacterium animalis probiotic strain in human faeces[J].J Appl Microbiol,2000,88：1019-1027.

[11]WIECKOWSKA-SZAKIEL M,BUBERT A,ROZALSKI M,et al.Colony-blot assay with anti-p60 antibodies as a method for quick identification of Listeria in food[J].Int J Food Microbiol,2002,72：63-71.

[12]REUNANEN J,VON OSSOWSKI I,HENDRIDKX A P A,et al.Characterization of the SpaCBA pilus fibers in the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG[J].Appl Environ Microbiol，2012，78：2337-2344.

[13]顧瑞霞，陳旭嬌，丁繆華，等.鼠李糖乳桿菌grx19及其應(yīng)用[P].中國(guó)：ZL201110441666.7，2012-12-12.

[14]薩姆布魯克J，拉塞爾著D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.北京：科學(xué)出版社,2002：68-105.

[15]GB 4789.35—2010,食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.