張哲，徐海燕，于潔

（1呼和浩特市第二中學(xué)，呼和浩特010090，2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引言

傳統(tǒng)食品的制作和食用已歷經(jīng)數(shù)千年，各個國家和民族幾乎都有自己獨(dú)特的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，因其品種豐富、味道鮮美、營養(yǎng)價值高而備受世界各國人民的青睞。俄羅斯卡爾梅克人在制作傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品也有著豐富的經(jīng)驗和悠久的歷史。俄羅斯卡爾梅克的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的種類主要包括：酸奶，酸奶油，奶渣、奶酪、開菲爾乳和馬奶酒等[1]。其中，酸奶油作為一種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，色澤乳白，風(fēng)味獨(dú)特，香濃可口，廣泛地被用于菜肴的烹飪和各類糕點的烘焙，它使各式菜倄多了一種奶香味，地位非常重要，就像中菜的醬油[2]。

酸奶油制作主要是經(jīng)過乳酸菌的發(fā)酵過程實現(xiàn)的，其中蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源。乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一群形態(tài)代謝性能和生理學(xué)特征不完全相同的能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌總稱[3]。由于乳酸菌具有改善腸道菌群、增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、降低血液膽固醇、降血壓等功能而呈現(xiàn)出極大的開發(fā)利用價值[4,5]。因此，隨著乳酸菌產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步的發(fā)展，傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌資源的開發(fā)和群落結(jié)構(gòu)分析逐漸成為研究的熱點。

本研究以俄羅斯卡爾梅克共和國3個地區(qū)采集的6份酸奶油樣品為研究對象，采用MRS培養(yǎng)基來分離其中的乳酸菌，利用16S rRNA基因序列分析法對乳酸菌進(jìn)行分類鑒定，依據(jù)乳酸菌種類和數(shù)量分析酸奶油中的乳酸菌多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源。

本試驗所用的6份酸奶油樣品是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室的研究人員于2012年9月14日-2012年9月20日，在俄羅斯卡爾梅克共和國的3個地區(qū)采集到的。酸奶油樣品的具體信息見表1。

表1 俄羅斯卡爾梅克共和國地區(qū)酸奶油的來源及乳酸菌活菌數(shù)

1.1.2 主要試劑與儀器。

MRS固體培養(yǎng)基（DifcoTM Lactobacilli MRS Agar，BD），MRS肉湯培養(yǎng)基（Man Rogosa Sharpe broth，Oxide），EasyTaq DNA polymerase、dNTPs（每種2.5 mmol/L）等PCR試劑均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成；PCR基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystems），Eppendorf 5810R冷凍離心機(jī)，CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng)，ND-1000型微量紫外分光光度計等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

先將容器中的酸奶油充分?jǐn)嚢?，用帶有滅菌吸頭的移液器吸取1.5 mL樣本放入裝有滅菌中和劑（淀粉/CaCO3，50：1，M/M）的無菌2.0 mL螺口凍存管中，混勻后用封口膜封口后標(biāo)記樣品號，放入4℃便攜式冰箱內(nèi)保持低溫度狀態(tài)，帶回實驗室后，盡快進(jìn)行微生物組成分析和乳酸菌的分離的實驗。

1.2.2 酸奶油中乳酸菌活菌計數(shù)

采用傾注法對樣品中的乳酸菌進(jìn)行活菌計數(shù)。將樣品用漩渦振蕩器混勻后，吸取0.5 mL樣品于4.5 mL的滅菌生理鹽水（0.85%，w/w）中，以10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，吸取1 mL稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液置于塑料培養(yǎng)皿中（d=9 cm）中，立即倒入約20 mL含有10 ppm放線菌酮和硫酸多粘菌素的MRS固體培養(yǎng)基（溫度為70℃左右），迅速搖勻，待完全凝固后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h。

1.2.3 乳酸菌的分離

用滅菌槍頭吸取1.2.2中所述稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液各200μ L，分別涂布于MRS平板 培 養(yǎng) 基 上，厭氧條件下30℃培養(yǎng)48～72 h，菌落形成后觀察菌落形態(tài)，依據(jù)菌落大小、顏色、光澤度、凸起度等差異，將所有形態(tài)特征不同的菌落做標(biāo)記，并在無菌條件下將標(biāo)記好的菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃厭氧培養(yǎng)24 h。繼續(xù)傳代后挑取適量菌體進(jìn)行革蘭氏染色試驗（涂片、固定、染色、脫色）和過氧化氫酶試驗。最終，將革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性的無芽孢的桿狀或球狀的菌株保存用于后續(xù)的實驗。

1.2.4 乳酸菌的鑒定

1.2.4.1 乳酸菌全基因組的提取。

采用液氮反復(fù)凍融-CTAB法提取分離株的基因組DNA,具體步驟參考見文獻(xiàn)[6]。將提取的基因組原液采用瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。

1.2.4.2 乳酸菌16S rRNA基因擴(kuò)增。

將上述制備的基因組DNA作為模板采用50μ L體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為：FA-27F：5-gcagagttctcggagtcacgaAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，RA-1495R：5-agcggatcacttcacacaggaCTACGGCTACCTTGTTACGA-3[7]。擴(kuò)增循環(huán)為：94℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若PCR成功則在1500 bp左右可見清晰的條帶。

1.2.4.3 16S rRNA基因序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

將PCR產(chǎn)物送到上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，每株菌獲得兩條16S rRNA基因的序列，運(yùn)用DNAStar 6.1軟件包中的SeqMan軟件將其進(jìn)行拼接，最終獲得1300bp-1400bp的有效序列。利用NCBI（National Center for Biotechnology Information）中的 Blast軟件 BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將測定的序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知分類地位的乳酸菌16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較。應(yīng)用軟件Mega 6.0中的Cluster W將模式菌株和所測菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行多重序列比對，在此基礎(chǔ)上采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。最后將所有測序菌株的16S rRNA基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶油中乳酸菌的活菌數(shù)及分離結(jié)果

俄羅斯卡爾梅克地區(qū)采集的6份酸奶油樣品中乳酸菌活菌數(shù)在7.30～8.62 lg cfu/mL間（見表1），均值為8.12±0.46 lg cfu/mL。這表明酸奶油中的乳酸菌資源較豐富。

根據(jù)菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，6份樣品中共分離到28株乳酸菌。菌株在MRS培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出邊緣整齊或呈鋸齒狀、中央突起、表面光滑或粗糙的白色、褐色或透明菌落。革蘭氏染色后桿菌的細(xì)胞形態(tài)有粗短、粗長、細(xì)長、細(xì)短形，少量為彎曲狀；球菌為圓形或橢圓形，成對、鏈、簇狀球排列。

2.2 乳酸菌16S rRNA基因序列鑒定結(jié)果

液氮凍融-CTAB法提取的乳酸菌基因組DNA大小在23 Kb左右，濃度和純度均滿足后續(xù)實驗要求。采用引物FA-27F和FR-1495R對乳酸菌分離株16S rRNA基因進(jìn)行了擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，可以觀察到在1500 bp的位置處有一條清晰明亮的條帶，無彌散和非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，如圖1所示。

圖1 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

將拼接完成的16S rRNA基因序列通過BLAST與數(shù)據(jù)庫中的菌株進(jìn)行同源性比較，如果同源性大于99%則可將其直接鑒定到種的水平。從每個種中挑取一株有代表性菌株的16S rRNA基因序列與模式菌株的序列利用軟件Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bacillus subtilis NCDO 1769作為外源菌種，Bootstrap值設(shè)定為1000。10株乳酸菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 10株乳酸菌代表菌株和模式菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖中可以看出，菌株IMAU90217和IMAU90063分別與Lactobacillus brevis ATCC14869、Lb.plantarum ATCC 14917的距離最近，且同源性達(dá)到99%以上，故被鑒定為L.brevis和L.plantarum。菌株IMAU90078與Lb.paracasei ATCC25302的親緣關(guān)系最近，而且它們的同源性為100%，因此可將其歸為Lb.paracasei。菌株IMAU90064和IMAU90219分別與乳球菌屬的模式株Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435和Lac.lactis subsp.cremoris ATCC 19257親緣關(guān)系最近，同源性分別為100%，故將它們分別鑒定為Lac.lactis subsp.lactis和Lac.lactis subsp.cremoris。在鏈球菌屬這一分支上，IMAU90031與Streptococcus hermophilus ATCC19258聚為一類，且其同源性均為99%以上，故鑒定為Streptococcus thermophilus。菌株IMAU90003、IMAU90002、IMAU90232和IMAU90153分別與明串株菌屬中的模式株Leuconostoc citreum ATCC 49370、Leu. lactis ATCC19256、Leu. pseudomesenteroides ATCC12291和Leu.mesenteroides ATCC8293的親緣關(guān)系最近，且它們之間的同源性均大于99%，可判定其分別為Leu.citreum、Leu.lactis、Leu.pseudomesenteroides和Leu.mesenteroides。

通過分離株的16S rRNA基因同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果表明，分離自俄羅斯卡爾梅克共和國的酸奶油中的28株乳酸菌鑒定為4個屬（Lactobacillus，Lactococcus，Leuconostoc和 Streptococcus）中的 10 個種，包括Lb.brevis（1株）、Lb.paracasei（1株）、Lb.plantarum（5株）、Lac.lactis subsp.lactis（2株）、Lac.lactis subsp.cremoris（5株）、Leu.citreum（1株）、Leu.lactis（3株）、Leu.mesenteroides（5株）、Leu.pseudomesenteroides（4 株）和S.thermophilus（1株）。具體鑒定結(jié)果和16S rRNA基因序列登錄號見表2。

3 討論

由于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品具有諸多益生保健功能，使得越來越多的研究學(xué)者致力于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)的研究。本研究中通過對俄羅斯卡爾梅克地區(qū)的酸奶油中乳酸菌的活菌計數(shù)和分離鑒定，證實了其中蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源，且種類較多。其中明串菌屬（Leuconostoc）是俄羅斯卡爾梅克地區(qū)的酸奶油中優(yōu)勢乳酸菌菌屬，占總分離菌數(shù)的50%。此外，Lb.plantarum和Lac.lactis subsp.lactis的分離株也較多。2009年，Idoui[9]等從阿爾及利亞東部地區(qū)的傳統(tǒng)奶油中分離出26株乳酸菌，它們被鑒定為三個屬Lactococcus，Leuconostoc和 Lactobacillus，其中 Lactococcus lactis subsp.diacetylactis是奶油中的優(yōu)勢菌群。2006年，Mourad[10]對阿爾及利亞撒哈拉地區(qū)的20份傳統(tǒng)奶油（shmen）進(jìn)行微生物構(gòu)成研究，結(jié)果表明分離出的181株乳酸菌鑒定為Lactobacillus plantarum（40株），Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus（35株），Lactococcus lactis subsp.lactis（22 株），Lactococcus lactis subsp.cremoris（18株）和Lactobacillus paracasei（10株）。通過與其它地區(qū)傳統(tǒng)奶油中乳酸菌的研究相比，俄羅斯卡爾梅克地區(qū)的酸奶油中的乳酸菌的種類和比例具有明顯的地域特點，我們推斷這可能與酸奶油的制作工藝、產(chǎn)地的環(huán)境氣候等因素有關(guān)。

表2 酸奶油中乳酸菌的種類及16SrRNA基因序列登錄號

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