索江華， 楊 森， 喬宏興

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程系，河南鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450046）

屎腸球菌是乳酸菌類益生菌的一種，能調(diào)整單胃動(dòng)物腸道菌群，抑制腸道內(nèi)致病菌的過度繁殖。其作為微生態(tài)制劑可單獨(dú)使用或與其他益生菌復(fù)配，用于調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群，提高免疫力及改善生長性能（容庭等，2008；文靜等，2001）。

乳酸菌凍干發(fā)酵劑是將乳酸菌和凍干保護(hù)劑一起進(jìn)行真空冷凍干燥得到的具有體積小、含菌量高、活力強(qiáng)、用量少、污染低、便丁運(yùn)輸、保藏，使用方便等優(yōu)點(diǎn)的制劑。為了提高微生物真空冷凍干燥后細(xì)胞的成活率及穩(wěn)定性，常在冷凍時(shí)加入各種保護(hù)劑，保護(hù)劑包括蛋白質(zhì)類、多糖類、小分子糖類、醇類和維生素類，其中被廣泛認(rèn)可的保護(hù)劑主要成分包括脫脂乳、蔗糖、海藻糖等。保護(hù)劑具有兩個(gè)作用，一是作為支持物和受體在復(fù)水過程中為干物質(zhì)提供一定的骨架結(jié)構(gòu)；二是冷凍干燥過程中保護(hù)活細(xì)胞。凍干保護(hù)劑可以有效地減少環(huán)境對菌體細(xì)胞的傷害，所以對其冷凍干燥保護(hù)劑的篩選和研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 屎腸球菌 （Enterococcus Faecium），購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種編號CICC 21067。

1.1.2 試劑與儀器 甘油，購自上海國藥集團(tuán)，分析純；脫脂奶粉（完達(dá)山）；蔗糖，購自上海國藥集團(tuán)，分析純；無菌水，自制。培養(yǎng)箱、pH計(jì)、離心機(jī)、光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺、-80℃冰箱 （DW-86L388A）、真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器 FD-1B-50）。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏 10 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫- 801 mL，乙酸鈉 5 g，檸檬酸銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，無水磷酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化和擴(kuò)培 取屎腸球菌凍存管1支，在MRS平板上劃線，37℃培養(yǎng)36～48 h，挑取單菌落接種于5 mL液體MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h后，菌種以5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)18～22 h，鏡檢無雜菌后，等量分裝9 mL于無菌離心管中，4000 r/min離心15 min，棄上清液收集菌體。革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌。

1.2.2 單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將滅菌后的甘油、脫脂乳、蔗糖分別按照表1的配比組合溶于100 mL蒸餾水中備用。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)配比組合試驗(yàn)表%

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取甘油、脫脂乳、蔗糖水平分別為：甘油1%、1.5%、2%，脫脂乳8%、10%、12%，蔗糖 3%、4%、5%，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，因素與水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.3 預(yù)凍及真空冷凍干燥 將離心所得菌泥樣品用滅菌后的保護(hù)劑溶液2 mL沖洗到無菌培養(yǎng)皿中，放在-80℃條件下預(yù)凍2 h，待樣品完全凍結(jié)后迅速轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)中，根據(jù)真空冷凍干燥機(jī)說明書和樣品量冷凍干燥24 h，即可收獲成品。

1.2.4 活菌計(jì)數(shù)及存活率計(jì)算 平板混菌計(jì)數(shù)法：樣品溶解于無菌水中混勻，以10倍梯度進(jìn)行稀釋，取適合的稀釋度0.1 mL涂布在MRS培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度涂布三個(gè)樣本，37℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，以菌落平均數(shù)計(jì)為該樣品的單位活菌數(shù)。設(shè)冷凍干燥前菌泥活菌數(shù)為N1（cfu/mL）；冷凍干燥后菌粉活菌數(shù)N2（cfu/mL）。

細(xì)胞冷凍存活率/%=（N2/N1）×100。

2 結(jié)果與分析

屎腸球菌在MRS上生長48 h的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果表明：屎腸球菌在顯微鏡下形態(tài)均一，主要成二聯(lián)球狀，或多連球狀，革蘭氏染色呈陽性；在MRS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h之后，菌落光滑，呈乳白色突起，具有明顯的乳酸菌特征。

2.1 單因素試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)最終確定取10-9梯度計(jì)數(shù)，三個(gè)樣本取平均值結(jié)果如下：A 30，B 41，C 36，D 194，E 145，F(xiàn) 132，G 300，H 39，I 174，J 459，K 98，L 35，M 178。 由此可知，單因素試驗(yàn)中活菌數(shù)保留最高的組合是J：甘油1%、脫脂乳10%、蔗糖4%或 5%（圖1）。

圖1 單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2.2 正交試驗(yàn) 由表3可知，影響屎腸球菌凍干后存活率的因素主次順序?yàn)镃蔗糖＞A甘油＞B脫脂乳，即蔗糖的效果最明顯極差可達(dá)到22.534，甘油次之，脫脂乳最小。通過優(yōu)化凍干保護(hù)劑的正交試驗(yàn)結(jié)果，可以得到屎腸球菌的最佳凍干保護(hù)劑配方為：甘油1.5 mL/100 mL，脫脂乳12 g/100 mL、蔗糖5 g/100 mL。屎腸球菌在使用此保護(hù)劑的情況下凍干存活率可以達(dá)到93.2%。

表4結(jié)果表明，三個(gè)因素對菌體存活率影響均不顯著，究其原因可能是本試驗(yàn)誤差略大且誤差自由度小，而且試驗(yàn)因素間存在交互作用，會(huì)夸大試驗(yàn)誤差，有可能掩蓋考察因素的顯著性。經(jīng)正交試驗(yàn)得到的最佳組合為6號試驗(yàn)組的凍干菌體存活率會(huì)更高。

表3 屎腸球菌保護(hù)劑的篩選

表4 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

3 討論與結(jié)論

3.1 乳酸菌細(xì)胞的凍干損傷 本研究中，乳酸菌活菌數(shù)減少的主要原因是冷凍和干燥過程引起的，許多研究者認(rèn)為在快速降溫時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞損傷的主要原因是細(xì)胞內(nèi)外冰晶生長產(chǎn)生的機(jī)械力量引起的溶質(zhì)損傷（Bumsoo和 John，2004）。溶質(zhì)損傷又稱“溶液損傷”，是由于水的凍結(jié)使細(xì)胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮，從而使電解質(zhì)的濃度顯著增加。由于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的存在導(dǎo)致細(xì)胞脫水，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)對高濃度的電解質(zhì)極為敏感，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，進(jìn)而喪失其功能，因此增加了細(xì)胞死亡的可能性。通常細(xì)胞膜中的磷脂的極性端在一定程度上是以水合形式存在的，而且每個(gè)磷脂的極性端與其他磷脂分子的極性端被水分子隔開。當(dāng)磷脂干燥脫水時(shí)，極性端的密度增加，糖鏈間的范德華引力增強(qiáng)，平時(shí)處于液晶態(tài)的脂膜變成凝膠態(tài)，相的變化使復(fù)水時(shí)細(xì)胞膜的通透性增加，胞內(nèi)一些可溶性物質(zhì)發(fā)生滲漏，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡（陳聲明和呂琴，1996）。細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)作用損傷是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)某一關(guān)鍵酶失活，會(huì)造成細(xì)胞代謝受阻，積累了影響正常生理功能的某種產(chǎn)物，從而整個(gè)細(xì)胞代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3.2 保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)理 甘油具有良好的滲透性，它能滲透到細(xì)胞內(nèi)部，以羥基和胞內(nèi)大分子形成氫鍵，部分取代由水分子形成的氫鍵，使生物體中的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和其他大分子物質(zhì)在缺水條件下仍可保持其原有結(jié)構(gòu)，維持生物體活力。關(guān)于糖類保護(hù)作用機(jī)理主要有兩大學(xué)說：“水替代假說”和“玻璃態(tài)假說”，總之生物活性物質(zhì)保護(hù)劑要有較高的玻璃態(tài)溫度，或有一定的羥基來替代水，使蛋白質(zhì)保持較低的主相變溫度，即有效保持活性。但目前這兩種假說還不能完全解釋現(xiàn)有的試驗(yàn)現(xiàn)象，所以其保護(hù)機(jī)理仍需深入研究。脫脂奶粉、可溶性淀粉等高分子保護(hù)劑溶于水，溶液可呈過冷狀態(tài)，即在冰點(diǎn)以下的相同溫度該溶液中的溶質(zhì)濃度較小，蛋白質(zhì)鹽析變性也較少。另外，它們能減少細(xì)胞暴露于氧氣和介質(zhì)中的面積，同時(shí)在菌體表面形成保護(hù)層，減少由于細(xì)胞壁損壞引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而起到保護(hù)作用。

不同的保護(hù)劑在凍干過程中發(fā)揮著不同的作用，一般認(rèn)為，低分子化合物（如低聚糖、氨基酸等）在凍干過程中直接發(fā)揮作用，而高分子化合物（如蛋白質(zhì)、多糖等）則可促進(jìn)低分子化合物的保護(hù)作用。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)（孫盈等，2011；朱東升等，2010；陳衛(wèi)等，2008），確定甘油、脫脂乳、多糖三種保護(hù)劑的最佳配比分別在2%、10%、1%，而本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)確定三種凍干保護(hù)劑最佳配比為甘油1%、脫脂乳10%、蔗糖5%。挑選部分有代表性的水平組合進(jìn)行正交試驗(yàn)，利用正交試驗(yàn)最終得出屎腸球菌真空冷凍干燥保護(hù)劑的優(yōu)化組合為甘油2 mL/100 mL、脫脂乳12 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL，凍干后菌體存活率超過93.2%。

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