曹俊敏 曹毅 ? 楊雪靜 楊曉紅 陶茂燦 趙競宜

·實(shí)驗(yàn)研究·

黃連解毒湯對白色念珠菌的抗真菌作用研究

曹俊敏 曹毅 ? 楊雪靜 楊曉紅 陶茂燦 趙競宜

目的 觀察黃連解毒湯對白色念珠菌的體外抗真菌效果。方法 采用微量稀釋法藥物敏感性試驗(yàn)測定黃連解毒湯對標(biāo)準(zhǔn)菌株、氟康唑敏感株、氟康唑中度敏感株、氟康唑耐藥株4種白色念珠菌的最低抑菌濃度。結(jié)果 黃連解毒湯對4種白色念珠菌均具有較好的抑制作用，其對白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的最低抑菌濃度為4mg/ml，對氟康唑敏感型白色念珠菌最低抑菌濃度為8mg/ml，對中度敏感型白色念珠菌最低抑菌濃度為16mg/ml，對耐藥型白色念珠菌最低抑菌濃度為 64mg/ml。結(jié)論 黃連解毒湯對白色念珠菌有明顯的抑制作用，可作為臨床用藥的參考。

念珠菌感染是目前臨床多見的一種真菌感染。隨著艾滋病的傳播，癌癥放化療的開展、器官移植后免疫抑制劑的應(yīng)用，以及導(dǎo)管等生物材料使用的增多，白色念珠菌感染率持續(xù)上升。臨床上通常推薦以唑類抗真菌藥物為主的治療方案。由于同類藥物的長期廣泛使用，導(dǎo)致念珠菌的耐藥問題日益突出。本課題組選取黃連解毒湯，研究其對白色念珠菌的體外抗真菌作用，為臨床用藥方案提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）菌株：白色念珠菌SC5314（ATCC MYA-2876），購于中國科學(xué)院。白色念珠菌氟康唑敏感株Y01.09（ATCC 76615-09）、白色念珠菌氟康唑中度敏感株Y01.108（ATCC 76615-108）、白色念珠菌氟康唑耐藥株 Y01.19（ATCC 76615-19），由南京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所真菌保存室饋贈。（2）主要試劑：黃連解毒湯粉末（10:1）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究所提供。蛋白胨（peptone）、葡萄糖（glucose）、瓊脂粉（Agar）、RPMI－1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜（DMSO）、超純水均訂購于上海生工生物工程有限公司。（3）主要儀器：多功能全波長酶標(biāo)儀購于Thermo Scientigic公司。IEC CL31R高速冷凍離心機(jī)（Multispeed）、 氣浴恒溫振蕩器購于江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。生化培養(yǎng)箱（HJX-250B-Z型）為上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。手提式壓力蒸汽滅菌鍋購于上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。電子天平（BSA223S）為賽多利斯科學(xué)儀器有限公司（Sartorius）產(chǎn)品。普通光學(xué)顯微鏡為上海光學(xué)儀器廠產(chǎn)品。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購于生工生物工程（上海）有限公司。（4）藥物貯存液的配制：將黃連解毒湯粉末溶于DMSO，加純水配置成終濃度256 mg/ml的藥物貯存液，后分裝于1.5ml無菌聚丙烯離心管中，取封口膜密封管口，保存于-80℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)取出解凍即可。藥物貯存液切勿反復(fù)凍融使用。在-60℃以下的溫度條件下，多數(shù)抗真菌藥物能保存至少6個(gè)月而不失去活性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）菌液的制備：取出保存于-80℃冰箱的白色念珠菌菌株，接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，連續(xù)傳代2次，挑取培養(yǎng)基上菌落直徑＞1mm的單個(gè)菌落，接種于含100 ml沙氏 液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置于恒溫?fù)u床，30℃，1500r/ min振蕩培養(yǎng)26h。取培養(yǎng)后的菌液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并用液體沙氏 培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×106CFU/ ml。（2）微量稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)：將配置好的黃連解毒湯貯存液加入96孔板中，起始藥物濃度為256mg/ml，然后在96孔平板上用RPMI-1640培養(yǎng)液連續(xù)倍比稀釋，使第2孔至第11孔的藥物濃度依次為128mg/ml，64mg/ml，32mg/ml，16mg/ml，8mg/ml，4mg/ml，2mg/ ml，1mg/ml，0.5mg/ml和0.25mg/ml，每孔100μl藥液。DMSO在每孔中含量均＜1%。第1孔和第12孔加不含藥的RPMI-1640培養(yǎng)液，第1孔為空白對照不接種菌液，第12孔作為生長對照接種菌液。將配置完成的菌液用微量移液器加入制備好的藥敏平板中，2至12孔每孔100μl；第1孔不加菌液，為空白對照空。將接種后的平板置于微量振蕩器上振蕩5min，使菌液與藥液混合均勻，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。（3）結(jié)果的判讀 孵育24h后觀察96孔板上受試菌株的生長狀況，以無菌生長的測試孔中藥物的濃度為此組的MIC值。每孔重復(fù)3次，當(dāng)MIC值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個(gè)濃度時(shí)才可接受；當(dāng)MIC值相差＞2個(gè)濃度時(shí)，則需重新實(shí)驗(yàn)，直到符合要求為止。

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯對白色念珠菌SC5314的抑菌效果 經(jīng)微量稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)測得，在濃度為4mg/ml的藥物孔中無菌生長，即黃連解毒湯對白色念珠菌SC5314（ATCC MYA-2876）的最低抑菌濃度為4mg/ ml。見表1。

2.2 黃連解毒湯對氟康唑敏感型白色念珠菌的抑菌效果 經(jīng)微量稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)測得，在濃度為8mg/ml的藥物孔中無菌生長，即黃連解毒湯對敏感型白色念珠菌的最低抑菌濃度為8mg/ml。見表1。

2.3 黃連解毒湯對氟康唑中度敏感型白色念珠菌的抑菌效果 經(jīng)微量稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)測得，在濃度為16mg/ml的藥物孔中無菌生長，即黃連解毒湯對中度敏感型白色念珠菌的最低抑菌濃度為16mg/ml。見表1。2.4 黃連解毒湯對氟康唑耐藥型白色念珠菌的抑菌效果 經(jīng)微量稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)測得，在濃度為64mg/ml的藥物孔中無菌生長，即黃連解毒湯對敏感型白色念珠菌的最低抑菌濃度為64mg/ml。見表1。

表1 黃連解毒湯對四種白色念珠菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

白色念珠菌（Candida albicans）又稱白假絲酵母菌，是一種真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病，為條件致病性真菌。當(dāng)機(jī)體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)，則本菌大量繁殖并改變生長形式（芽生菌絲相）侵入細(xì)胞引起疾病，嚴(yán)重的深部真菌感染可危及患者的生命［1，2］。

氟康唑是目前臨床上治療白色念珠菌感染的首選藥物，被廣泛作為預(yù)防性和治療性藥物使用，且該類藥物的作用方式為抑菌作用，因此療程長，在長期使用過程中逐漸使耐藥真菌比例增多或出現(xiàn)耐藥突變。日益嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象和有限的治療藥物使白色念珠菌感染成為臨床上迫切需要解決的問題［3］。目前對中藥活性物質(zhì)及復(fù)方的作用機(jī)制研究主要是參照西醫(yī)藥理學(xué)中抑菌機(jī)制的研究思路，在分離提取藥物有效成分后研究中藥活性物質(zhì)及復(fù)方對體外真菌的直接抑制作用，從其有效成分的作用機(jī)制來解釋中藥的作用［4，5］。

黃連解毒湯，首載于葛洪《肘后備急方》，是祖國醫(yī)藥中已發(fā)現(xiàn)的具有良好抗菌作用的藥劑之一，由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，具有清熱、瀉火、解毒功效，主治一切實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證。現(xiàn)代研究認(rèn)為黃連解毒湯除了對多種細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、乙型鏈球菌和變形桿菌均有抑制作用外，對白色念珠菌的抗菌作用亦較顯著。單用黃連或黃連素，對細(xì)菌或真菌等較易產(chǎn)生抗藥性，而用本方則可避免，且可以提高抑菌作用，有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，增加解毒能力，減輕單味藥的毒性和副作用的優(yōu)點(diǎn)［6］。

本實(shí)驗(yàn)采用微量稀釋法藥物敏感性實(shí)驗(yàn)研究了黃連解毒湯對白色念珠菌的抗菌活性，對白色念珠菌SC5314（ATCC MYA-2876）的最低抑菌濃度為4mg/ ml，對敏感型白色念珠菌最低抑菌濃度為8mg/ml，對中度敏感型白色念珠菌最低抑菌濃度為16mg/ml，對耐藥型白色念珠菌最低抑菌濃度為 64mg/ml。實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃連解毒湯對標(biāo)準(zhǔn)株、敏感株、中度敏感株、耐藥株4種白色念珠菌均有較好的抗真菌作用。中藥具有來源廣、毒性小、價(jià)格低和少耐藥等優(yōu)點(diǎn)，因此黃連解毒湯對白色念珠菌的抑菌作用在臨床上有良好的應(yīng)用前景。

1 Arendrup MC. Epidemiology of invasive candidiasis. Curr Opin Crit Care, 2010,16(5): 445～452

2 Kothavade RJ,Oberai CM,Valand AG,Panthaki MH. Disseminated cryptococcosis and fluconazole resistant oral candidiasis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome(AIDS). J Infect Dev Ctries, 2010,4(10): 674～678.

3 曹毅,翁鶴,楊曉紅,等. 高通量測序技術(shù)在黃連解毒湯抗白念珠菌機(jī)制研究中的應(yīng)用及探討. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2013,6(1):55～59

4 陳降華,丁飛,李文平.中草藥抗呼吸道病毒感染的研究進(jìn)展.中獸醫(yī)學(xué)雜志,2009(3):54～56.

5 陳虹.中草藥對禽獸8種腸道病原菌的體外抑菌試驗(yàn).蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,2009.

6 黃悼偉.黃連解毒湯藥理研究及臨床應(yīng)用進(jìn)展.中醫(yī)藥信息,1993,12(6):37～39.

Objective To explore the anti-fungal Activity of Huanglian jiedu decoction（HLJDD）against Candida albicans in vitro. Methods Through microdilution assay，we investigate the effect of Huanglian jiedu decoction on Candida albicans and explore the MIC of four different kinds of Candida albicans including standard strain，sensitive strain，neutral strain，and drug resistant strain of Candida albicans. Results The standard strain of c. albicans grows fast within 24 to 32 hours and after 56 hours the viable counts of c. albicans decline. MIC of Huanglian jiedu decoction against sensitive strain and standard strain of Candida albicans was 8 mg/ml and 4 mg/ml，and that of neutral strain was 16 mg/ml，while that of drug resistant strain was 64 mg/ml. Conclusion Huanglian jiedu decoction could inhibit the growth of C.albicans in vitro.

Huanglian jiedu decoction Candida albicans Chinese herb antifungal

國家自然科學(xué)基金（81173271）

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

*通訊作者