蔡巧英 華漢巨

大腸癌中Neuropilin-1的表達(dá)與血管生成的關(guān)系

蔡巧英 華漢巨

目的 探討大腸癌組織中神經(jīng)纖毛蛋白-1（NRP-1）的表達(dá)與大腸癌生物學(xué)行為及血管生成的關(guān)系和意義。方法 應(yīng)用免疫組化SP 法檢測正常大腸黏膜、大腸癌組織中NRP-1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、CD34的表達(dá)并測定微血管密度（MVD）。結(jié)果 大腸癌組織中NRP-1的表達(dá)及MVD高于正常大腸粘膜組織，且與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度密切相關(guān)。NRP-1表達(dá)陽性組的MVD高于陰性組。與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)性。結(jié)論 NRP-1參與了大腸癌的發(fā)生、浸潤與轉(zhuǎn)移；NRP-1與大腸癌的血管生成有關(guān)；NRP-1作為腫瘤抗血管治療的靶點(diǎn)具有一定的價(jià)值。

大腸癌 神經(jīng)纖毛蛋白-1 血管生成 免疫組化

大腸癌是常見的消化道腫瘤之一，隨著人們生活水平提高及飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變，我國大腸癌發(fā)病率呈上升趨勢。 神經(jīng)纖毛蛋白-1（NRP-1）為collapsin/semaphorin 家族受體，在神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向、軸突生長方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1可作為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族成員的受體，在腫瘤血管新生方面發(fā)揮重要作用。作者通過檢測大腸癌組織中NRP-1、VEGF、CD34的表達(dá)并計(jì)數(shù)微血管密度（MVD），探討大腸癌組織中NRP-1的表達(dá)與血管生成的關(guān)系和意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集本院外科2010年1月至2013年10月手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查確診的大腸癌組織及正常大腸組織標(biāo)本各52例，其中男31例，女21例；年齡48～76歲，平均年齡68歲。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫等治療。腫瘤位于結(jié)腸13例、直腸39例。腫瘤分期按Dukes分期。鼠抗人NRP-1單克隆抗體購自英國Abcam公司，鼠抗人VEGF、CD34單克隆抗體及SP試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法 （1）免疫組化：采用免疫組化SP 法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。以PBS液代替一抗作為陰性對照，公司提供陽性片作為陽性對照。（2）陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：NRP-1、VEGF陽性染色信號為棕黃色或棕褐色顆粒，結(jié)果判定采用Volm雙評分法［1］，高倍視野下觀察每張切片染色均勻區(qū)陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率，并分別進(jìn)行分級記分，染色強(qiáng)度：0分：不染色；1分：輕度染色（淡黃色）；2分：中度染色（黃色）；3分：強(qiáng)染色（棕黃色或黃褐色）。陽性細(xì)胞率：1分：陽性細(xì)胞＜25%。2分：25%～50%。3分：＞50%。按上述兩項(xiàng)之和判斷結(jié)果：0分：陰性（-）。1～2分：弱陽性（+）。3～4分：陽性（++）。5～6分：強(qiáng)陽性（+++）。共計(jì)數(shù) 5 個視野，取平均值。（3）MVD計(jì)數(shù)：參照Krishnan等［2］的方法：CD34 陽性表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色或棕黃色染色，以被染成棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為 1 個血管計(jì)數(shù)。低倍（×40）下觀察，確定3個血管著色最密集的區(qū)域，然后在高倍（×400）下計(jì)數(shù)這3個視野的微血管數(shù)，取其平均值為該片的MVD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 軟件處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、Fisher 精確概率法。MVD以（x±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析。等級相關(guān)采用非參數(shù)Spearman 等級相關(guān)分析。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織中NRP-1的表達(dá)情況及MVD比較 大腸癌組織中NRP-1主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞膜上和胞質(zhì)內(nèi)，以胞質(zhì)為主，呈棕黃色或棕褐色的顆狀物質(zhì)，彌漫分布于整個胞質(zhì)或沿胞膜周邊呈線狀分布。CD34標(biāo)記大腸癌組織中微血管多集中于癌灶邊緣，血管缺乏完整性，管壁缺乏平滑肌。大腸癌組織中NRP-1陽性率為69.23%（36/52），MVD為（73.13±17.31），均明顯高于正常大腸組織的NRP-1陽性率3.85%（2/52）和MVD（22.32±5.25），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 正常大腸和大腸癌組織的NRP-1表達(dá)及MVD比較

2.2 NRP-1的表達(dá)與大腸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 在不同性別、年齡、腫瘤的部位、細(xì)胞分化程度的組別，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、浸潤深度、不同Dukes分期組別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2 。

表 2 大腸癌組織中NRP-1、VEGF的表達(dá)及MVD與臨床病理特征的關(guān)系（x±s）

2.3 大腸癌組織中NRP-1 的表達(dá)與 MVD 的關(guān)系 見表3。

Ochsenbein等［3］最先于1987年在非洲蟾蜍神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的一種與神經(jīng)生長導(dǎo)向有關(guān)的細(xì)胞膜表面I型跨膜糖蛋白，稱Neuropilin。NRP有兩個亞型：NRP-1和NRP-2，它們結(jié)構(gòu)相似，約47%氨基酸序列同源。NRP為collapsin/semaphorin 家族受體，在神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向、軸突生長方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1是VEGF亞型特異性受體，能與VEGF165結(jié)合，促進(jìn)腫瘤新生血管生成。

很多腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等，都發(fā)現(xiàn)有NRP-1的表達(dá)。Hansel等［4］研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1在一些消化道腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中，隨著腺體的發(fā)育異常從低到高，癌前病變組織中NRP-1表達(dá)強(qiáng)度和范圍隨之增加，提示NRP-1可能與消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。胡希宏等［5］對胃癌的研究也發(fā)現(xiàn)，NRP-1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度相關(guān)。本資料顯示，NRP-1在腫瘤≥5cm組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、漿膜及漿膜外浸潤組的大腸癌組織中陽性率明顯升高，提示NRP-1的表達(dá)與大腸癌的腫瘤生長、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤浸潤有關(guān)。

新生血管的生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，腫瘤血管生成為腫瘤生長提供了必須的營養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤體積增大。另一方面，腫瘤組織內(nèi)血管密度增加，促使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血管發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率加大。MVD 反映了腫瘤組織的血管生成狀態(tài)，已廣泛應(yīng)用于腫瘤血管生成的研究。腫瘤血管生成受多種血管生成因子和血管生成抑制物的調(diào)控，VEGF 是中心調(diào)控因子。NRP-1是VEGF165的復(fù)合受體，其生物學(xué)功能主要與VEGF165和VEGFR-2（血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體）有關(guān)。AnaCatarina等［6］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞協(xié)同表達(dá)NRP-1、VEGFR-2可加強(qiáng)VEGFl65與VEGFR-2的結(jié)合，增強(qiáng)VEGFl65介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞趨化活性及有絲分裂原性。NRP-1是通過調(diào)節(jié)VEGF與VEGFR-2結(jié)合及其生物活性而影響VEGF誘導(dǎo)血管形成的［7］。Miao等［8］誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞過度表達(dá)NRP-1的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤體積顯著增大、腫瘤毛細(xì)血管密度增加、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管擴(kuò)張。本資料顯示，NRP-1陽性表達(dá)組的MVD 顯著高于陰性組，表明NRP-1在大腸癌的血管生成中起促進(jìn)作用。且大腸癌組織中NRP-1與VEGF共同陽性表達(dá)者占46.15 %，表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)。提示NRP-1促血管生成機(jī)制與VEGF有關(guān)。

綜上所述，作者認(rèn)為NRP-1基因的過度表達(dá)在大

表3 大腸癌組織中NRP-1的表達(dá)與 MVD 的關(guān)系（x±s）

2.4 大腸癌組織中NRP-1、VEGF 表達(dá)的相關(guān)性 NRP-1與VEGF共同陽性表達(dá)者占46.15 %（24/52），表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)，r=0.27，P=0.02。

3 討論

腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用，可作為評價(jià)大腸癌生物學(xué)行為的指標(biāo)之一，NRP-1的表達(dá)與大腸癌的血管生成有關(guān)，因此NRP-1作為腫瘤抗血管治療的靶點(diǎn)具有一定的價(jià)值。

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2 Krishnan Kulumani Mahadevan,Debdatta Basu,Swarup Kumar. Does CD34 Staining Reflect the Angiogenic Process in the Bone Marrow? An Analysis of a Series of Chronic Myeloid Leukemia Patients. J Clin Diagn Res. 2014, 8(5): FC04～FC07.

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Objective To explore the expression of Neuropilin-1（NRP-1） in colorectal carcinoma tissue，analyze and identify the relationship between the expression and tumor angiogenesis together with biological behaviour in colorectal carcinoma. Methods SP immunohistochemical method was performed to detect the expression of NRP-1，VEGF and CD34，the value of microvascular density（MVD）in surgically resected colorectal carcinoma specimens and normal colorectal tissues was evaluated.Results The positive expression of NRP-1 and CD34 in colorectal carcinoma specimens were signifi cantly higher then in normal colorectal tissues，and also the expression and MVD were closely related to lymph node metastasis and depth of invasion. The MVD in the groups of NRP-1 positive-expression were signifi cantly higher than in negative-expression groups. There were positive correlations between the expression of NRP-1 and VEGF in colorectal carcinoma. Conclusions The expression of NRP-1 is participated to the invasion and metastasis of colorectal carcinoma. NRP-1 is participated to the tumor angiogenesis on colorectal carcinoma. NRP-1 can be selected as target for tumor anti-angiogenesis treatment.

colorectal carcinoma Neuropilin-1 Angiogenesis Immunohistochemistry

322109 浙江省東陽市人民醫(yī)院外科（蔡巧英）

310009 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肛腸外科（華漢巨）