張　瑞　(咸陽市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，陜西　咸陽　712000)

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對糖尿病腎病大鼠腎臟結(jié)締組織生長因子的干預(yù)效果

張瑞(咸陽市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，陜西咸陽712000)

〔摘要〕目的觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對糖尿病大鼠腎組織纖維結(jié)締生長因子(CTGF)表達(dá)的影響。方法SD大鼠高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立2型糖尿病模型，并按隨機(jī)數(shù)字表法分為:糖尿病腎病對照組(DN)、干細(xì)胞移植組(MSC)、前列地爾組(AL)。非糖尿病大鼠作為正常對照組(NC)。MSCs經(jīng)體外培養(yǎng)、鑒定、標(biāo)記后，經(jīng)尾靜脈注射到MSC大鼠體內(nèi)(6×106MSCs/ml)，同時AL大鼠每日經(jīng)尾靜脈注射10 μg·kg－1·d－1，連續(xù)注射21 d。于開始治療后第7、14、21天測定大鼠血糖、24 h尿總蛋白、血肌酐、尿素氮，采用HE染色觀察大鼠腎臟病理變化并應(yīng)用免疫組化檢測腎組織CTGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果與NC組比較，造模鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐、尿素氮均顯著升高(P＜0. 05); 與DN組比較，MSC組及AL組血肌酐、尿素氮、尿蛋白均顯著降低(P＜0. 05);與NC組比較，DN組腎組織CTGF表達(dá)顯著升高(P＜0. 05);與DN組比較，MSC組及AL組腎組織CTGF表達(dá)顯著降低(P＜0. 05)，但仍高于NC組(P＜0. 05);與AL組比較，MSC組血肌酐、尿素氮、尿蛋白、腎組織CTGF的表達(dá)均顯著降低(P＜0. 05)。結(jié)論MSCs可以抑制CTGF蛋白的過度表達(dá)，進(jìn)而減緩DN的病程進(jìn)展。

〔關(guān)鍵詞〕糖尿病腎病;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;結(jié)締組織生長因子

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，約30%的糖尿病患者會發(fā)展DN。Allard等〔1〕報道，高血糖、非酶糖基化產(chǎn)物和血流動力學(xué)紊亂均可刺激腎臟合成及釋放一些細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-)β、纖維結(jié)締生長因子(CTGF)等，CTGF是一種重要的促纖維化因子，在腎臟可由系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，CTGF的表達(dá)升高是導(dǎo)致DN腎纖維化的重要原因〔2〕。Semedo等〔3〕利用MSCs治療由于大部腎臟切除所致的殘余腎纖維化模型，發(fā)現(xiàn)MSCs能夠使體內(nèi)能趨化、歸巢到受損傷組織，并且能減輕腎臟纖維化。因此本實(shí)驗(yàn)擬探討MSCs對DN的治療機(jī)制。

1　材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動物2只體質(zhì)量為90～100 g健康雄性SD大鼠作為MSCs供鼠，54只體質(zhì)量為(200±10)g雄性SD大鼠54只，清潔級(徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境。自由進(jìn)食，12 h光照周期。

1. 2試劑胎牛血清(FBS)購自杭州四季青，L-DMEM培養(yǎng)基購自北京賽默，抗鼠CD29、CD90、CD34購自Biolegend公司，5-溴脫氧尿苷嘧(BrdU)購自沃宏，鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma，CTGF及BrdU抗體購自Boster，前列地爾購自北京泰德制藥股份有限公司。

1. 3 MSCs的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記取90～100 g雄性SD大鼠，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，剪去股骨、脛骨兩端，用生理鹽水反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸浮液，1 200 r/min離心5 min后棄去上清液，在細(xì)胞沉淀中加入含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，混勻后接種在于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5%二氧化碳(CO2)孵育箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合至80%～90%時進(jìn)行傳代，通過反復(fù)傳代對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增純化。取擴(kuò)增2代(P2)的大鼠MSCs，體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)21 d后行茜紅素染色鑒定鈣結(jié)節(jié)〔4〕;用流式細(xì)胞儀檢測鑒定表型抗原CD90、CD29、CD34。P3代細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時，加入含2%血清的BrdU終濃度為10 μmol/L的L-DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2孵育3 d。

1. 4造模與分組將SD大鼠采用完全隨機(jī)方法分成對照組12只和造模組42只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，造模組大鼠飼予高糖高脂飼料(在普通飼料的基礎(chǔ)上加上20%的豬油，5%的奶粉、10%的蔗糖)。喂養(yǎng)8 w后，造模組大鼠以35 mg/kg的劑量一次性腹腔內(nèi)注射STZ(溶于0. 1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4. 2)，對照組大鼠按相同劑量注射檸檬酸緩沖液。STZ注射2 w后，尾靜脈取血，隨機(jī)血糖(PG)≥16. 7 mmol/L伴胰島素敏感性降低〔5〕，則DN成模。STZ注射6 w后，出現(xiàn)尿微量白蛋白＞30 mg/24 h尿，則DN造模成功。造模成功的SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為: DN組、干細(xì)胞移植組(MSC組)、前列地爾組(AL組)。非糖尿病大鼠作為正常對照組(NC組)。按上述標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)研究中4只造模大鼠死亡，2只不符合標(biāo)準(zhǔn)。

1. 5處理用生理鹽水將BrdU標(biāo)記的P3代MSCs制成單細(xì)胞懸液，取0. 5 cm經(jīng)尾靜脈注射(6×106/ml)MSCS組大鼠1次，AL組大鼠每日經(jīng)尾靜脈注射劑量10 μg·kg－1·d－1，連續(xù)21 d;同時，NC組、DN組尾靜脈注射等量生理鹽水。

1. 6標(biāo)本收集及檢測處理7、14、21 d將大鼠置于代謝籠內(nèi)收集24 h尿液過濾后－80℃保存，以作尿蛋白定量測定。隨后稱量大鼠體重，用水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，下腔靜脈采血，取血清－80℃保存待測尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)。剖腹后取出大鼠雙腎，用生理鹽水灌洗后，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，以備免疫組織化學(xué)和HE染色普通光鏡檢查。

1. 7腎臟病理檢測取10%甲醛溶液中固定的腎臟，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切5 μm薄片，HE染色，光鏡下觀察其形態(tài)。

1. 8免疫組織化學(xué)檢測CTGF表達(dá)將石蠟包埋的腎組織制成5 μm厚切片后行免疫組織化學(xué)分析，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。①切片常規(guī)脫蠟脫水，3%的雙氧水室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶，雙蒸水洗5 min，3次;②抗原修復(fù):切片浸入0. 01 mol/L檸檬酸緩沖液中用微波進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后PBS洗滌3次;③滴加第一抗體(一抗)即兔抗鼠CTGF，抗體(1∶50稀釋，4℃過夜)，37℃復(fù)溫30 min，PBS浸洗，3 min，2次;④次日每張切片滴加試劑一，37℃溫箱30 min，PBS浸洗3 min 2次;⑤每張切片滴加試劑二，37℃溫箱20 min。PBS浸洗，5 min 4次;⑥最后在室溫、顯微鏡下DAB顯色、觀察顯色效果，當(dāng)顯色5～20 min，觀察至DAB顯色呈棕黃色時用自來水終止顯色;⑦DAB顯色終止后，再用蘇木素輕度復(fù)染、鹽酸分化、碳酸鋰返藍(lán)，依次用下列酒精梯度(75%，80%，95%，100%Ⅰ，100%Ⅱ)脫水、二甲苯透明、封片。同時采用PBS代替第一抗體的方法作為陰性對照。結(jié)果判斷:陽性著色呈棕黃色。每個標(biāo)本在400倍光鏡下隨機(jī)選取8個視野，采用Olympus公司圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，染色陽性部位的深淺以平均光密度值表示。

1. 9 Brdu熒光免疫組化檢測5 μm石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精脫水，1%Triton X-100室溫作用20 min，PBS洗滌3次，5 min。2NHCL變性30 min，PBS洗滌3次，5 min。1%BSA封閉1 h，滴加Brdu一抗(1∶50稀釋，4℃過夜)。37℃復(fù)溫30 min，F(xiàn)ITC-IgG室溫1 h，甘油封片后熒光顯微鏡觀察。

1. 10統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16. 0軟件，計量資料以x ±s表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，2組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊者應(yīng)用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊者用Tamhane’s T2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2　結(jié)果

2. 1 MSCs的分離純化、體外擴(kuò)增、鑒定擴(kuò)增第3代的大鼠MSCs，形態(tài)呈基本一致的長梭形、旋渦狀生長(圖1)。體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)染色陽性，證明成骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功(圖2)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD90陽性率為95. 98%，CD29陽性率為92. 93%，CD34陽性率為2. 16%。

圖1　 P3代大鼠MSCS(×200)

圖2　 P2代大鼠MSCS誘導(dǎo)成骨(×200)

2. 2各組大鼠PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白比較在各時間點(diǎn)，DN組、MSC組及AL組PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白較NC組明顯升高(均P＜0. 05); MSC組及AL組Scr、BUN、24 h尿蛋白較DN組顯著降低(均P＜0. 05)，與AL組比較，MSC組上述指標(biāo)明顯減少，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0. 05); MSC組PG較NC組顯著減少(均P＜0. 05)，AL組BG與DN組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0. 05)。見表1。

2. 3腎組織病理光鏡下NC組大鼠腎組織形態(tài)正常; DN組可見腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增生，系膜細(xì)胞增多，少數(shù)腎小球出現(xiàn)輕度硬化;腎小管壁不規(guī)則增厚，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，管腔變窄;局灶性的小管間質(zhì)纖維化。MSC組、AL組上述病理改變均有不同程度的減輕(圖3)。

表1　各組大鼠PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白比較(x ±s，n=12)

2. 4腎組織CTGF的表達(dá)NC組大鼠在腎小球、腎小管上皮細(xì)胞偶有CTGF陽性表達(dá); DN組大鼠腎小管上皮細(xì)胞CTGF陽性表達(dá)顯著增加，腎間質(zhì)區(qū)也有表達(dá)。與DN相比，MSC組和AL組，CTGF表達(dá)量均顯著減少(P＜0. 05)。見表2，圖4。

2. 5免疫熒光結(jié)果免疫熒光圖片可見標(biāo)記的MSC定位在腎小球、腎小管和腎間質(zhì)。見圖5。

圖3　各組3 w大鼠腎組織HE染色(×400)

表2　各時間點(diǎn)大鼠腎組織CTGF蛋白的表達(dá)(x ±s，n=12)

圖4　各組大鼠腎組絹CTGF(DAB，×400)

圖5　第14天BrdU免疫熒光(×400)

3　討論

DN主要病理改變特點(diǎn)為腎小球細(xì)胞外基質(zhì)聚集、腎小球硬化及進(jìn)展性腎小管間質(zhì)纖維化。纖維化是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要病理特征之一。迄今為止，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。除了蛋白激酶C(PKC)學(xué)說、氧化應(yīng)激(OS)學(xué)說、細(xì)胞因子學(xué)說及遺傳分子學(xué)說之外，許多實(shí)驗(yàn)和臨床資料均提示糖尿病腎病還存在炎細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)水平上升，炎癥可能單獨(dú)或作為上述機(jī)制的下游環(huán)節(jié)在DN損害的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用〔6，7〕。其中CTGF在DN腎臟纖維化中的作用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同〔8，9〕。因此，抑制CTGF的表達(dá)可以延緩DN的進(jìn)展。MSCs具有易采集且體外大量擴(kuò)增并不丟失細(xì)胞核型和表面標(biāo)志、可自我更新、能向多種類型細(xì)胞分化、增殖能力強(qiáng)并能分泌多種細(xì)胞因子〔10～12〕，因而是一種具有重要應(yīng)用價值的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)利用全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)的細(xì)胞呈貼壁生長，能誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀測定其干細(xì)胞表面抗原CD90、CD29為陽性，白細(xì)胞表面特征抗原CD34為陰性，說明培養(yǎng)的細(xì)胞為干細(xì)胞而非同樣具有貼壁特性的白細(xì)胞，從而確保輸注前的細(xì)胞為具有分化功能的MSCs〔13，14〕。本研究將體外擴(kuò)增并標(biāo)記的MSCs輸注入制模成功的DN大鼠，經(jīng)熒光免疫組化發(fā)現(xiàn)在腎臟中存在標(biāo)記的干細(xì)胞，說明干細(xì)胞能定向趨化到受損的腎臟。MSC組大鼠血糖、Scr、BUN、24 h尿蛋白明顯降低;腎臟病理圖片發(fā)現(xiàn)與DN組比較，MSC組大鼠腎臟病變明顯減輕，說明MSCs能延緩腎臟纖維化的進(jìn)程，對腎臟有明顯的保護(hù)作用;從免疫組化方法中蛋白的表達(dá)情況來看，MSCs對DN大鼠腎臟保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過降低腎組織CTGF的表達(dá)，抑制腎組織纖維化，進(jìn)而延緩DN的病程進(jìn)展。

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〔2014-01-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

·心、腦血管及代謝性疾病·

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5753-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 031

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R589

第一作者:張瑞(1988-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事糖尿病腎病研究。