郭芳，田娟，趙越超

（遼寧醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，遼寧 錦州 121001）

·論著·

小鼠腎發(fā)育中膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族受體α1和受體酪氨酸激酶的表達*

郭芳，田娟，趙越超

（遼寧醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，遼寧 錦州 121001）

目的研究小鼠腎發(fā)育過程中膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族受體α1（GFRα1）和受體酪氨酸激酶（RET）的表達及意義。方法應用免疫熒光和蛋白印跡技術(shù)檢測各胚齡小鼠腎組織中GFRα1和RET的時空定位表達及蛋白含量變化。結(jié)果在腎發(fā)育早期，GFRα1和RET在輸尿管芽上皮細胞開始表達，生后腎組織內(nèi)僅見GFRα1表達。隨著腎小體的發(fā)育，GFRα1在腎小體發(fā)育早期即小泡體、逗號小體和S小體均有表達，而在腎小體發(fā)育后期即毛細血管袢期腎小體和未成熟期腎小體表達減弱，在成熟腎小體未見表達。RET在各期腎小體均未見表達。隨著早期髓質(zhì)的出現(xiàn)，GFRα1在近端小管、遠端小管和集合管有明顯表達；RET在集合管表達。在成熟腎臟，GFRα1定位表達于近端小管、遠端小管和集合管；RET定位表達于集合管。GFRα1和RET在腎臟的蛋白表達量隨胚齡的增加而增加，生后1 d達峰值，隨后兩者的蛋白表達量隨日齡的增加而逐漸減少。結(jié)論在腎發(fā)育中，GFRα1參與腎小體發(fā)生、早期發(fā)育過程及腎小管和集合管的發(fā)生、發(fā)育過程，并維持其正常生理功能。RET參與集合管的發(fā)生、發(fā)育過程，并維持其正常生理功能。

膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族受體α1；受體酪氨酸激酶；腎；發(fā)育；

膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）受體包括GDNF家族受體α1（GDNF family receptor α1，GFRα1）和受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RET）兩種。其中，GFRα1為糖基化磷脂酰肌醇錨定受體，缺乏跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；RET則有膜外、跨膜和膜內(nèi)成分，起信號傳導作用[1-2]。GFRα1和RET通過與GDNF結(jié)合，調(diào)控體內(nèi)多個器官系統(tǒng)的發(fā)育及維持其生理功能[3-4]。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，GFRα1和RET參與腎臟輸尿管芽發(fā)生及形態(tài)學分支[5]，并提出兩者通過與GDNF結(jié)合調(diào)控腎臟的發(fā)生、發(fā)育過程，但具體的調(diào)控機制國內(nèi)尚無文獻報道。另有研究表明，GFRα1和RET的異常表達與某些腎發(fā)育畸變疾病如腎母細胞瘤有關(guān)[6]。因此在前期研究的基礎(chǔ)上[7]，本實驗觀察GFRα1和RET在小鼠腎臟發(fā)育過程中的表達變化，為進一步闡明其在腎臟發(fā)育中的調(diào)控機制奠定形態(tài)學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康昆明小鼠（體重25～30 g），購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（遼）2008-0005。

1.2 實驗試劑

GFRα1兔多克隆抗體（sc-10716）、RET兔多克隆抗體（sc-167）購自美國Santa公司，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的羊抗兔免疫球蛋白IgG購自武漢博士德生物工程有限公司，3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH）鼠單克隆抗體購自上?？党缮锕荆燮蚁╬olyvinylidene fluoride，PVDF）膜、蛋白Marker購自NEB公司，ECL（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒購自美國Pierce公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本制備小鼠按雌雄比例1∶1同窩飼養(yǎng)，以觀察到陰道栓脫落的最早時間計為胚齡（embryonic days，E）0 d[7]。孕鼠分籠飼養(yǎng)，每天上午8∶00、下午5∶00觀察生產(chǎn)，以觀察到仔鼠出生的最早時間計為生后（neonatal days，N）0 d。分別取胚齡12、14、16、18 d胎鼠和生后1、7、14、21和40 d仔鼠腎臟，每組8只，每只孕鼠最多取2只胎鼠或仔鼠。孕鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，胚齡12 d全胚固定，胚齡14、16、18 d取其左腎固定。仔鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，于腹后壁取出左腎，用排刀法沿橫軸將腎臟切開，置于4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋，5μm連續(xù)切片。各組小鼠取右腎，入液氮迅速冷凍，置入-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.3.2 免疫熒光技術(shù)切片常規(guī)脫蠟、水化，滴加5%驢血清（normal donkey serum，NDS）室溫孵育1 h，甩去多余液體，不洗；滴加GFRα1或RET兔多克隆抗體（工作液濃度1∶100）置入4℃孵化箱過夜，滴加FITC標記的熒光二抗室溫孵育2 h，用防淬滅封片劑封片，共聚焦激光掃描顯微鏡（激發(fā)波長為488 nm）觀察并采集圖像[7]。以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作陰性對照組。上述各步驟用0.01 mol/L PBS沖洗。

1.3.3 蛋白印跡檢測取冷凍待用右腎分別稱質(zhì)量，用小剪刀將組織塊盡量剪碎（冰上操作），加入4倍體積的蛋白裂解液，超聲粉碎，4℃過夜，冷凍離心機4℃、12 000 r/min離心30 min，去除細胞碎片，取上清液，考馬斯亮藍法進行蛋白定量[7]。樣品取50μg與6×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（GFRα1和RET工作液濃度為1∶700）置入4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（工作液濃度1∶5 000）室溫孵育2 h，HRP-ECL蛋白檢測發(fā)光鑒定，凝膠電泳圖像分析儀進行采圖。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，P＜0.05有差異統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測

胚齡12 d，GFRα1在輸尿管芽上皮細胞及生后腎組織微弱表達；而RET在輸尿管芽上皮細胞微弱表達，生后腎組織未見表達。隨著腎小體發(fā)育，GFR α1在小泡體、逗號小體和S小體均有表達，表達逐漸增強；在毛細血管袢期腎小體及未成熟期腎小體表達減弱，在成熟腎小體未見表達。RET在各期發(fā)育階段的腎小體未見陽性表達。隨著早期髓質(zhì)的出現(xiàn)，GFRα1在近端小管、遠端小管和集合管有明顯表達；RET在集合管有明顯表達。在成熟腎臟中，GFR α1主要定位表達于近端小管、遠端小管和集合管；RET主要定位表達于集合管。見圖1、2。

圖1 GFRα1在小鼠腎臟表達的免疫熒光染色

圖2 RET在腎臟表達的免疫熒光染色

2.2 蛋白印跡檢測

隨著胚齡的增加，GFRα1和RET在腎臟表達量逐漸增加，生后1 d表達量最高，隨后GFRα1和RET在腎臟表達量逐漸減少。見圖3。

圖3 小鼠腎臟發(fā)育各階段GFRα1和RET蛋白表達變化

3 討論

哺乳動物腎臟發(fā)育是輸尿管芽和生后腎組織相互誘導的結(jié)果。以小鼠為例，胚齡12 d輸尿管芽及其分支出現(xiàn)，生后腎組織呈帽狀圍繞在輸尿管芽及分支周圍；胚齡14 d，輸尿管芽分支周圍出現(xiàn)小泡體、逗號小體、S小體，這部分皮質(zhì)稱為生腎區(qū)；胚齡16 d，大多數(shù)腎小體仍停留在逗號小體、S小體階段，可見到少量Ⅲ和Ⅳ期的髓旁腎小體，即第1代成熟腎小體出現(xiàn)；胚齡18 d，早期髓質(zhì)出現(xiàn)，髓質(zhì)由少量近直小管、遠直小管、細段和集合管構(gòu)成，其間散在大量間質(zhì)，相當于成年后的髓質(zhì)外帶外區(qū)；生后1 d，被膜下仍有生腎區(qū)，但相對面積減少，髓質(zhì)外帶內(nèi)區(qū)出現(xiàn)；生后7 d，皮質(zhì)生腎區(qū)消失，只有Ⅳ期腎小體存在，腎小體發(fā)育基本成熟，集合管不再分支，髓放線出現(xiàn)，可見近直小管，遠直小管和集合管，腎乳頭可見由遠端小管直部、細段以及集合管構(gòu)成的髓質(zhì)外帶內(nèi)區(qū)；隨后，皮質(zhì)增厚，髓質(zhì)可區(qū)分為髓質(zhì)外帶內(nèi)外區(qū)；生后40 d，腎發(fā)育達到成年水平[8]。

有研究表明，GFRα1和RET參與腎臟發(fā)生、發(fā)育過程。1998年TOWERS等[9]發(fā)現(xiàn)，GFRα1和RET在腎臟表達，參與腎發(fā)生、發(fā)育過程。2003年CAMASSEI等[6]通過免疫組織化學檢測腎胚細胞瘤中GFRα1和RET的陽性表達，證實GFRα1和RET參與誘導腎胚細胞瘤的細胞分化。2004年CHARLETBERGUERAND等[10]報道GDNF家族復合受體GFRα1是RET信號轉(zhuǎn)換的重要成分，與神經(jīng)細胞和腎發(fā)育有關(guān)，其活性可被GDNF激活。2006年COSTANTINI等[11]證實，GDNF/RET信號系統(tǒng)是腎臟發(fā)育中輸尿管芽正常生長的必要條件，但GDNE/RET信號在腎分支形態(tài)學的作用機制仍不清楚。2008年SKINNER等[12]提出人類RET和GDNF突變可能導致腎發(fā)育異常。2009年LU等[13]發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中，缺乏Etv4和Etv5等位基因會導致腎發(fā)育不良，并推測Etv4和Etv5是RET的下游信號。JAIN[14]報道GFRα1或RET缺失將導致腎發(fā)育不全，引起圍產(chǎn)期死亡，在人類先天性腎畸形中可檢測出RET基因突變。

本研究顯示，胚齡12 d時，GFRα1和RET分別在小鼠腎臟輸尿管芽和生后腎組織開始表達，表明兩者對腎臟的發(fā)生起關(guān)鍵作用。在腎小體的發(fā)育過程中，GFRα1在腎小體早期發(fā)育階段有表達；在發(fā)育后期減弱，成熟腎小體未見表達，說明GFRα1參與腎小體的發(fā)生及早期分化、增殖，而對腎小體的后期發(fā)育及功能可能不起關(guān)鍵作用。隨著早期髓質(zhì)的出現(xiàn)，GFRα1在近端小管、遠端小管和集合管有明顯的表達，RET在集合管有表達。說明兩者分別參與腎小管和集合管的形態(tài)發(fā)生、發(fā)育過程。在成熟腎臟中，GFRα1定位表達于近端小管、遠端小管和集合管；RET定位表達于集合管，與其他研究結(jié)果相似[9，11]。表明兩者在維持腎臟正常生理功能方面同樣發(fā)揮重要作用。蛋白印跡結(jié)果顯示，隨著胚齡的增加，GFRα1和RET在腎臟表達量表現(xiàn)為先遞增，達到峰值之后逐漸遞減，其峰值出現(xiàn)在生后1 d。本研究首次發(fā)現(xiàn)，GFRα1和RET在腎臟發(fā)育過程中的表達變化特點，該特點具有的生理意義還有待于進一步研究。因此，GFRα1和RET可參與腎臟不同結(jié)構(gòu)的發(fā)生、發(fā)育過程，并維持其正常生理功能。然而，兩者是如何通過其信號通路調(diào)控腎發(fā)育過程，還有待下一步研究。

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（張蕾 編輯）

Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α1 and receptor tyrosine kinase in kidney development of mouse*

Fang GUO,Juan TIAN,Yue-chao ZHAO
(Department of Histology and Embryology,Liaoning Medical College, Jinzhou,Liaoning 121001,P.R.China)

【Objective】To investigate the expressions of glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α1(GFR α1)and receptor tyrosine kinase(RET)during renal development of mice and the significance.【Methods】The expressions of GFR α1 and RET were examined by immunofluorescence.The protein content of GFR α1 and RET in the kidneys of embryonic and neonatal mice was measured by Western blot.【Results】In the early development of kidney,GFR α1 and RET began to express in epithelium of ureteric bud,and only GFR α1 appeared in metanephrogenic tissue.Along with the development of renal corpuscles, GFR α1 was expressed in the early-development renal corpuscles such as vesicle bodies,comma-shaped bodies and S-shaped bodies；but the expression was reduced in the later-stage renal corpuscles and disappeared in mature renal corpuscles.RET was not expressed in renal corpuscles of any stage.Along with the emerging of early medulla,GFR α1 was also expressed in proximal tubules,distal tubules and collecting ducts of developmental and mature kidney.RET was expressed in collecting ducts of developmental and mature kidney.Western blot results showed the expressions of GFRα1 and RET in kidney increased along with embryonic age andreached to the peak on N1 d.Then,the expressions of GFR α1 and RET in kidney decreased along with neonatal age.【Conclusions】GFR α1 may participate in the generation and early development of renal corpuscles and in the development and function of proximal tubules,distal tubules and collecting ducts.RET may participate in the development and function of collecting ducts.

glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α l；receptor tyrosine kinase；kidney；development

R329.461；R-332

A

1005-8982（2015）30-0013-05

2015-04-23

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（No：201410160037）；遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（No：201410160037）；遼寧省教育廳科學技術(shù)研究項目（No：L2012307）；遼寧省科學技術(shù)計劃項目（No：2013022067）

田娟，E-mail：tian555juan555@sina.com