張 劍　竇 懿　廖鎮(zhèn)江

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院燒傷科，上海 200025）

應(yīng)用絲素膜真皮支架對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中成纖維細(xì)胞功能的影響

張 劍竇 懿廖鎮(zhèn)江

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院燒傷科，上海 200025）

目的：動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)面應(yīng)用絲素膜真皮支架對(duì)創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中成纖維細(xì)胞(Fb)功能的影響。方法： 50只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為聚乙烯醇海綿組（海綿組）和絲素膜組（n=25）。于大鼠背部正中切取皮膚制成2 cm×2 cm全層皮膚缺損創(chuàng)面，分別在創(chuàng)面埋植聚乙烯醇海綿（海綿組）或絲素膜（絲素膜組），再覆以自體刃厚皮縫合。術(shù)后1、2、3、4、6周取移植物及其周圍組織，HE染色觀察其組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)組織α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果：光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1～2周，絲素膜組肉芽組織化較海綿組快，膠原纖維較密集；術(shù)后6周，與海綿組相比, 絲素膜組膠原纖維較粗大,組織相對(duì)成熟。術(shù)后組織中α-SMA及TGF-β1表達(dá)增加，α-SMA表達(dá)量于術(shù)后2周達(dá)到高峰，之后逐漸下降。絲素膜組α-SMA表達(dá)量低于海綿組，在第1、6周與海綿組比較差異有顯著性(P＜0.01)；海綿組TGF-β1表達(dá)量于術(shù)后2周達(dá)到高峰，絲素膜組于術(shù)后第3周達(dá)高峰，除第3周外，絲素膜組TGF-β1表達(dá)量均低于海綿組，在第1、2、6周與海綿組比較差異有顯著性(P＜0.01)。絲素膜組細(xì)胞凋亡率在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)均顯著高于海綿組 (P＜0.01)。結(jié)論：絲素膜與自體刃厚皮復(fù)合移植后，可不同程度減少Fb中α-SMA及TGF-β1的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加快組織重塑，有利于組織修復(fù)的完成，對(duì)防止瘢痕過(guò)度形成具有積極意義。

絲素膜α-平滑肌肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1細(xì)胞凋亡創(chuàng)面愈合

利用組織工程原理構(gòu)建人工皮膚替代物用于皮膚移植，可有效解決嚴(yán)重?zé)齻痛竺娣e燒傷供皮不足的難題。雖然目前已有許多較為成熟的皮膚修復(fù)材料，但它們都存在諸多缺陷，其中成本過(guò)高和再生修復(fù)性能不足是關(guān)鍵[1]。家蠶蠶絲中的絲素蛋白成分是一種天然的高分子聚合物，作為手術(shù)縫線用于臨床已有100多年的歷史。近年來(lái)，由于其低免疫原性、良好的生物相容性及特有的理化性質(zhì)，絲素蛋白作為一種新的生物材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注[2]。成纖維細(xì)胞（Fb）是創(chuàng)面愈合的主要修復(fù)細(xì)胞之一，參與多種細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。本研究中，我們將絲素蛋白制成多孔結(jié)構(gòu)的支架材料—絲素膜，應(yīng)用于大鼠真皮缺損創(chuàng)面，觀察絲素膜植入后對(duì)Fb生物學(xué)行為的影響，了解其在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的作用。聚乙烯醇具有與人體組織相近的含水量、良好的生物相容性和較高的機(jī)械強(qiáng)度，在生物醫(yī)學(xué)方面獲得了廣泛的應(yīng)用。本研究中我們采用商品化聚乙烯醇海綿作為對(duì)照組，觀察絲素膜的應(yīng)用效果。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備將聚乙烯醇海綿（北京康安生物技術(shù)有限公司）和絲素膜材料（蘇州大學(xué)材料工程學(xué)院）剪成20 mm×20 mm大?。ê? mm），浸于生理鹽水中備用。 SPF級(jí)雄性SD大鼠（購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）50只，體重230～250 g，隨機(jī)分為絲素膜組和海綿組，每組25只。于術(shù)前1 d硫化鋇脫毛， 2.5%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，背部消毒，用手術(shù)刀于背部正中切取2 cm×2 cm全層皮膚，并反取成刃厚皮備用。絲素膜組和海綿組創(chuàng)面分別埋植絲素膜材料和聚乙烯醇海綿，外加自體刃厚皮縫合（厚度為0.20 mm），包扎，換藥。于術(shù)后1、2、3、4和6周取材，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)取材動(dòng)物數(shù)5只，切取移植物及其周圍組織，立刻以4%甲醛固定備用。

1.2觀察指標(biāo)與方法

1.2.1組織學(xué)觀察標(biāo)本固定后常規(guī)脫水，透明，浸蠟包埋，制備4 μm連續(xù)切片，黏附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，明礬蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.2免疫組化法檢測(cè)創(chuàng)面組織中平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）表達(dá)采用SP法(試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)，主要步驟如下：石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；室溫下內(nèi)源性過(guò)氧化酶封閉液作用10 min，0.1 mol/L、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗10 min；羊血清蛋白封閉15 min；加入小鼠源性一抗（抗α-SMA及TGF-β1單抗，分別購(gòu)自Abcam公司及DAKO公司，工作液濃度分別為1∶300和1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜；PBS漂洗3 min×3次；羊抗小鼠二抗室溫孵育30 min；PBS漂洗3 min×3次；加SP試劑，室溫作用30 min；PBS漂洗3 min×3次；5 mg重氮氨基苯（DAB）+ PBS 10 ml+0.3%雙氧水100 μl，顯色3～5 min；流水沖洗、蘇木素襯染、脫水，中性樹(shù)脂封片。以棕褐色深染為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.3TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡凋亡試劑盒購(gòu)自DAKO公司，主要步驟如下：石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；內(nèi)源性過(guò)氧化酶封閉液室溫封閉10 min；室溫下蛋白酶K抗原修復(fù)10 min， PBS漂洗3 min×3次；加入平衡緩沖液孵育5 min；加TDT酶，37 ℃孵育1 h；室溫下加終止緩沖液孵育10 min；PBS漂洗3 min×3次；鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶室溫孵育30 min；PBS漂洗3 min×3次；DAB顯色3～5 min；流水沖洗、蘇木素襯染、脫水，中性樹(shù)脂封片。以棕褐色深染為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3資料分析方法采用KS400圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)Kaiser公司）。免疫組化結(jié)果：200倍鏡下每張切片隨機(jī)選取2個(gè)視野，測(cè)量窗面積為94 879.82 μm2，測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞面積百分比（陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積/測(cè)量窗面積）。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：200倍鏡下每張切片隨機(jī)選取2個(gè)視野，采圖后人工計(jì)數(shù)，測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）。

2　結(jié) 果

2.1組織學(xué)觀察術(shù)后1周，兩組創(chuàng)面光鏡下觀察均可見(jiàn)Fb和炎癥細(xì)胞遷入支架，近基底部細(xì)胞較多。術(shù)后 2周植入支架材料內(nèi)細(xì)胞數(shù)量大量增加,布滿整個(gè)材料,肉芽組織形成增加,絲素膜組膠原纖維較海綿組密集；隨著材料肉芽組織化，植入材料有所降解(圖1，見(jiàn)封二)。術(shù)后3～6周，與海綿組比較,絲素膜組Fb數(shù)量減少，膠原纖維較粗大,形成組織相對(duì)成熟，材料與周圍組織融合較好。

2.2TGF-β1表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，術(shù)后絲素膜組及海綿組TGF-β1表達(dá)均上升，海綿組于術(shù)后2周達(dá)到高峰，絲素膜組于術(shù)后第3周達(dá)高峰，之后逐漸下降。除第3周外，絲素膜組TGF-β1表達(dá)量均低于海綿組，術(shù)后第1、2、3、6周與海綿組比較，差異均具有顯著性[P＜0.01，圖2、圖3（見(jiàn)封二）]。結(jié)果表明：絲素膜支架植入體內(nèi)后能夠減少TGF-β1的表達(dá)。

圖2　不同支架材料處理后創(chuàng)面組織中TGF-β1的表達(dá)

2.3α-SMA的表達(dá)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面愈合早期，兩組創(chuàng)面組織中α-SMA表達(dá)量均上升，呈強(qiáng)陽(yáng)性，術(shù)后2周達(dá)到高峰，之后逐漸下降。絲素膜組α-SMA表達(dá)量低于海綿組，在第1周、6周與海綿組比較差異有顯著性 (P＜0.01)。術(shù)后第6周，海綿組組織中α-SMA表達(dá)量雖明顯減少，但仍呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。而絲素膜組第6周α-SMA呈弱陽(yáng)性表達(dá) [表1、圖4(見(jiàn)封二）]。結(jié)果表明，創(chuàng)面愈合后期絲素膜支架能夠減少α-SMA的表達(dá)。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè)術(shù)后1～6周，絲素膜組及海綿組細(xì)胞凋亡率逐漸上升，絲素膜組細(xì)胞凋亡率在術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)均高于海綿組[圖5、圖6（見(jiàn)封二）]，兩者相比差異有顯著性（P＜0.01）。表明絲素膜支架植入創(chuàng)面后能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖5　創(chuàng)面不同支架材料組織中細(xì)胞凋亡率的比較

表1　術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積百分比（x± s，%， n=5）

3　討　論

絲素膜是由絲素蛋白經(jīng)物理或化學(xué)方法合成的三維生物支架材料。絲素蛋白是蠶絲的主要成分，其無(wú)毒性，無(wú)抗原刺激性，具有良好的生物相容性及可降解性[2]，并具備來(lái)源廣泛、純度高、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，絲素蛋白的分子結(jié)構(gòu)和形態(tài)還可以通過(guò)表面修飾技術(shù)等多種方法加以改進(jìn)，這些特性使得絲素蛋白在生物材料和組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用變得日益廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白對(duì)機(jī)體細(xì)胞黏附能力強(qiáng)，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，如絲素蛋白材料可在體外用作培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等的載體，細(xì)胞生長(zhǎng)良好[3]。理想的皮膚替代物除能快速血管化外，還需能夠調(diào)控Fb等修復(fù)細(xì)胞功能以使其既能滿足組織充填替代的作用、又不會(huì)導(dǎo)致過(guò)度增生而影響修復(fù)效果。研究證實(shí)，應(yīng)用絲素膜后能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管化[4]。本研究中觀察了絲素膜對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中Fb生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其作為生物真皮支架應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)的可能性。

需要說(shuō)明的是，雖然組織中尚存在其他細(xì)胞，但考慮到 Fb是真皮層參與創(chuàng)面修復(fù)的主要細(xì)胞，占據(jù)數(shù)量上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，故本研究通過(guò)檢測(cè)組織中α-SMA、TGF-β1表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡水平來(lái)反映Fb的表達(dá)水平。本研究所采用的“復(fù)合移植”方法（皮膚替代物+自體刃厚皮移植）不同于非植皮的自然愈合創(chuàng)面，故未采用創(chuàng)面愈合時(shí)間作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，只能通過(guò)生化指標(biāo)來(lái)間接反映組織修復(fù)。

研究認(rèn)為，病理性瘢痕中細(xì)胞外基質(zhì)尤其是膠原的過(guò)度沉積，與Fb功能異?；钴S、分泌大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)[5]。肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)是Fb的分化亞型，因其細(xì)胞中表達(dá)α-SMA而得名。正常皮膚組織中α-SMA僅見(jiàn)于血管平滑肌細(xì)胞，創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，參與創(chuàng)傷修復(fù)的Fb中亦可見(jiàn)α-SMA的表達(dá)[6]，因此這種類似平滑肌細(xì)胞的Fb又稱MFB。研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞亞型不僅具有Fb的旺盛合成功能，還因其表達(dá)有α-SMA而具有比Fb更強(qiáng)的收縮功能[7]。正常愈合情況下，如正常愈合的切口傷中，MFB可短暫出現(xiàn)，在創(chuàng)面愈合后即通過(guò)凋亡途徑被清除，而在瘢痕過(guò)度增生或纖維化疾病中則持續(xù)大量存在[8]。Desmoulière等[9]研究認(rèn)為，雖然MFB在創(chuàng)面愈合和組織重塑中發(fā)揮了重要作用，但愈合后期，功能活躍的MFB或Fb的凋亡延遲或不足，則可能成為導(dǎo)致瘢痕過(guò)度增生的一個(gè)重要原因。本研究檢測(cè)了組織中α-SMA和細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果顯示，術(shù)后2～4周絲素膜組與海綿組相比α-SMA的表達(dá)無(wú)顯著差異，術(shù)后6周則顯著低于海綿組，表明創(chuàng)面修復(fù)高峰期絲素膜并未明顯影響Fb向MFB轉(zhuǎn)化的比例，但在創(chuàng)面愈合后期可促進(jìn)MFB比例的下調(diào)。術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)絲素膜組細(xì)胞凋亡水平均顯著高于對(duì)照組，表明絲素膜可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。推測(cè)，絲素膜不但可以調(diào)控創(chuàng)面愈合后期組織中MFB的比例，還可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡適時(shí)清除Fb，防止功能活躍的Fb持續(xù)大量存在，有助于改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。

TGF-β1作為重要的致纖維化因子，是目前已知與瘢痕形成關(guān)系最密切、最具代表性的功能多樣的生長(zhǎng)因子。TGF-β1的一個(gè)重要功能是促進(jìn)α-SMA在Fb中的表達(dá)，誘導(dǎo)Fb向MFB的轉(zhuǎn)化[10]；TGF-β1還可通過(guò)抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)及穩(wěn)定Bcl-2家族蛋白的水平而拮抗多種促細(xì)胞凋亡因子的作用，抑制MFB的凋亡[11]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶之一，MMPs及其組織抑制因子（TIMPs）的相對(duì)水平在基質(zhì)的沉積與重塑中發(fā)揮重要作用[12]。TGF-β1可抑制Fb中MMP的活性[13]，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，影響組織重塑進(jìn)程。因此，TGF-β1的高表達(dá)有利于Fb轉(zhuǎn)化為MFB，持續(xù)地發(fā)揮其收縮及合成功能，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，在組織修復(fù)中起重要作用，但如果過(guò)度表達(dá)，可能會(huì)導(dǎo)致瘢痕的過(guò)度增生。本研究中絲素膜應(yīng)用后可在一定程度上減少TGF-β1的表達(dá)，有利于調(diào)控MFB的形成及細(xì)胞凋亡水平、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，影響創(chuàng)面愈合過(guò)程。而組織學(xué)觀察顯示，絲素膜組膠原纖維較粗大, 形成組織相對(duì)成熟，材料與周圍組織融合較好，可能與絲素膜調(diào)控Fb功能、加速組織重塑有關(guān)。

雖然絲素膜組α-SMA、TGF-β1量較低，但其早期組織填充效果要優(yōu)于海綿組，愈合后期組織較海綿組成熟，能夠獲得這種結(jié)果可能跟絲素膜組有較為合適的孔徑有關(guān)。海綿組孔徑較大，不利于組織填充及組織重塑的完成。

綜上所述，絲素膜應(yīng)用后對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中Fb生物學(xué)行為的影響有助于改善深度缺損創(chuàng)面的愈合質(zhì)量，可作為生物支架材料用于皮膚組織缺損的修復(fù)。當(dāng)然，如何通過(guò)改進(jìn)工藝使絲素膜達(dá)到最佳的治療效果，最大程度地減少瘢痕形成，仍有待深入、系統(tǒng)的研究。

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Effect of silk fibroin membrane as dermal scaffold on the fibroblast behaviors in wound healing

Zhang Jian , Dou Yi, Liao Zhenjiang.
Department of Burn Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine, ShangHai 200025, China

Objective: To dynamically investigate the effect of silk fibroin membrane as dermal scaffold on the fibroblast behaviors in wound healing. Methods: Fifty male SD rats with a full-thickness wound the size of 2 cm×2 cm on the back skin were randomly divided into 2 groups. The silk fibroin membrane group was covered by silk fibroin membrane with overlying thin split-thickness autograft, while that of the sponge group was covered by a PVA sponge and split-thickness autograft as control. Wound specimens were obtained at 1st, 2nd, 3rd, 4th, and 6th week post operation. Histological changes of wound tissues were observed with HE staining, and α-smooth muscle actin (α-SMA) and expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) were detected by immunohistochemical staining, and cell apoptosis was revealed by TUNEL assay. Results: HE staining showed faster formation of granulation tissue and denser collagen fiber in silk fibroin membrane group than in sponge group 1-2 weeks after surgery. Six weeks after operation, the collagen fiber in the silk fibroin membrane group was thicker and the newly-formed tissue was relatively mature as compared with that of the sponge group. The expression of α-SMA and TGF-β1 was increased gradually during wound healing in both groups, and α-SMA expression reached a peak in 2nd week, and then it decreased. The silk fibroin membrane group showed a lower expression of α-SMA than that of the sponge group, and the difference was markedly significant at 1st and 6th week (P＜0.01). The expression of TGF-β1 reached a peak at 2nd week in sponge group, whereas the peak appeared in 3rd week in silk fibroin membrane group, and it was significantly lower when compared with that of sponge groups at 1st, 2nd and 6th week(P＜0.01). The percentage of cell apoptosis was significantly higher in silk fibroin membrane group during the designed experimental time when compared with sponge group (P＜0.01). Conclusions: The silk fibroin membrane when used together with split-thickness autograft could reduce the expression of α-SMA and TGF-β1 in different degrees, promote cell apoptosis, and speed up tissue remodeling, suggesting that it might improve tissue formation and prevent excessive scar formation.

Silk fibroin membraneα-smooth muscle actinTransforming growth factor-β1Apoptosis Wound healing

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 04 . 001

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目資助（G1999054205）

2015-07-29)