王勇濤　董 寧　柴艷芬　于 燕　齊安龍　姚詠明

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津 300052；2. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048)

microRNA-449b對高遷移率族蛋白B1介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞功能的影響

王勇濤1董 寧2柴艷芬1于 燕2齊安龍1姚詠明2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津 300052；2. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100048)

目的：探討miR-449b在高遷移率族蛋白B1（HMGB1）刺激樹突狀細(xì)胞（DC）中的變化及其對DC免疫功能的影響。方法：分別以10、100、1 000 ng/ml劑量的HMGB1刺激小鼠脾臟來源的CD11c+DC，于48 后檢測DC表面分子CD80、CD86、MHC-II及細(xì)胞內(nèi)miR-449b改變；流式細(xì)胞儀分析不同劑量HMGB1刺激對DC凋亡的影響。DC轉(zhuǎn)染miR-449b模擬物（miR-449b）、抑制物（In-miR-449b）及相應(yīng)對照（miR-NC、In-miRNC）后，HMGB1（100 ng/ml）刺激48 h收取細(xì)胞，檢測DC表面分子、凋亡改變以及與T細(xì)胞混合培養(yǎng)后T細(xì)胞增殖、分化功能的變化。結(jié)果：HMGB1刺激DC后，其表面分子隨著劑量的增加表達(dá)上調(diào)，其中以100 ng/ml組上調(diào)最為明顯，而大劑量（1 000 ng/ml）時(shí)表達(dá)有所下調(diào)；miR-449b 在48 h 100及1 000 ng/ml HMBG1組表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；隨著HMGB1劑量的增加，DC在48 h凋亡逐漸增加（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染miR-449b可上調(diào)其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而抑制物可抑制其表達(dá)；上調(diào)miR-449b后HMGB1（100 ng/ml）刺激48 h DC表面分子CD86表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）、凋亡增加（P＜0.01）、對T細(xì)胞的共刺激增殖效應(yīng)減弱、混合性淋巴細(xì)胞反應(yīng)中IL-4水平增多（P＜0.01）、IFN-?水平下降（P＜0.05）。結(jié)論：miR-449b可負(fù)性調(diào)控HMGB1介導(dǎo)DC免疫功能及促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而在機(jī)體免疫反應(yīng)障礙過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

miR-449b樹突狀細(xì)胞高遷移率族蛋白B1免疫功能

膿毒癥（sepsis）是由感染引起的失控性全身炎癥反應(yīng)及器官功能障礙，并伴有免疫功能紊亂[1-3]。我們新近研究證實(shí)，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為膿毒癥重要晚期炎癥介質(zhì)，參與了機(jī)體免疫功能紊亂過程，它可導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞（DC）表型異常，進(jìn)而使T細(xì)胞的增殖能力減弱、向Th2漂移，并可直接抑制T細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡[4-5]。微小RNA（microRNA, miRNA）是指長約20～25個(gè)核苷酸序列的非編碼RNA，其通過形成RNA誘導(dǎo)的靜默復(fù)合體（miRNA-induced silencing complex, RISC），以堿基互補(bǔ)配對的方式使靶向mRNA降解或翻譯抑制來發(fā)揮作用[6]。許多資料提示，miRNA在DC的分化、成熟、抗原提呈、細(xì)胞因子釋放及凋亡方面具有重要調(diào)控作用[7]。有學(xué)者通過對比未成熟DC（iDC）、成熟DC（mDC）及耐受性DC（tDC）的miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，與iDC相比，miR-449b在mDC及tDC中均表達(dá)上調(diào)[8]。采用鈣離子激動(dòng)劑使Jurkat T細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多后發(fā)現(xiàn),miR-449b水平明顯升高[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討HMGB1刺激DC中miRNA-449b的變化規(guī)律及其對DC免疫功能、凋亡的可能影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑BALB/c雄性小鼠（清潔級），6～8周齡，體重20～22 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。小鼠脾臟組織淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋科技有限責(zé)任公司，MiniMACS 磁性分離儀、MS柱、抗小鼠DC（CD11c）免疫磁珠、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記抗小鼠MHCⅡ、別藻青蛋白（APC）標(biāo)記的小鼠CD80、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記CD86均購自德國Miltenyi Biotec公司；PE-cy7標(biāo)記的抗小鼠CD11c、重組人HMGB1購自美國Sigma公司；PE Annexin V 凋亡試劑盒I 購自美國BD公司；總RNA提取TRIzol 試劑盒及LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM購自美國Gibco公司；miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SYBR Green熒光定量試劑盒購自美國AB公司；CCK8檢測試劑盒購自美國Sigma公司；小鼠IFN-?、IL-4 ELISA試劑盒購自依科賽生物科技（太倉）有限公司。

1.2HMGB1對DC表面分子表達(dá)、DC凋亡及miRNA-449b表達(dá)的影響

1.2.1小鼠脾臟來源CD11c+DC的提取頸椎脫臼法處死小鼠后無菌取脾，將脾臟置于預(yù)冷的PBS中，按淋巴細(xì)胞分離液說明書要求研磨脾臟分離單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)，加入相應(yīng)體積的CD11c磁珠孵育20 min后，在磁場中過兩遍MS柱分選DC，計(jì)數(shù)，流式分析儀檢測其純度，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活性，采用相應(yīng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整密度為1×106/ml種板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2HMGB1對DC表面分子表達(dá)及DC凋亡影響的檢測提取DC后用10% FCS-RPMI 1640完全培養(yǎng)基以1×106/ml重懸,以每孔400 μl接種于24孔板中，適應(yīng)性培養(yǎng)8 h后，分別加入含不同濃度HMGB1（10、100、1 000 ng/ml）的100 μl培養(yǎng)基，于48 h收取細(xì)胞，按流式抗體說明書要求檢測CD80、CD86及MHC-II時(shí)效及量效表達(dá)情況。檢測不同濃度HMGB1刺激DC 48 h后其凋亡情況，收取細(xì)胞后冷PBS清洗兩次，加入100 μl 結(jié)合緩沖液后加入Annexin V和7-AAD各5 μl，常溫黑暗孵育15 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.2.3miR-449b在HMGB1刺激DC中的表達(dá)變化將3×106個(gè)DC加入T25培養(yǎng)瓶中，加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基共5 ml置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后分別加入不同濃度的HMGB1（10、100、1 000 ng/ml），作用48 h后收取細(xì)胞。每3×106個(gè)細(xì)胞加入1 ml TRIzol，按要求提取總RNA。檢測提取的總RNA濃度及純度，取2 μg用于加尾反轉(zhuǎn)獲得microRNA的cDNA。將cDNA稀釋50倍,取6 μl進(jìn)行qPCR檢測。miR-449b特異性上游引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，miR-449b上游引物采用ULTRAPAGE純化，序列為5’-GGCAGGCAGTGTTGTTAGCTGG-3’；miR-449b、U6通用下游引物及U6特異性上游引物由miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒提供。采用熒光染料法（SYBR Green）檢測miR-449b量的變化，體系為20 μl分別為mix 10 μl、上下游引物各2 μl（5 μm）及6 μl的cDNA，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 60 s，95 ℃ 20 s，保證60～90 ℃溶解曲線為單峰。采用相對定量法以目的基因與內(nèi)參U6的CT值進(jìn)行比較。以2-ΔΔCT值（ΔCt=Ctgene-Ctcontrol）計(jì)算相對定量表達(dá)(RQ)值。

1.3miR-449b對DC表面分子表達(dá)、DC凋亡及促使T細(xì)胞增殖和極化的檢測

1.3.1miR-499b轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效果檢測miR-449b模擬物、抑制物以及陰性對照均由吉瑪公司設(shè)計(jì)合成；miR-449b抑制物序列為5’-GCCAGCU AACAACACUGCCU-3’，miR-449b 抑制物陰性對照序列為5’-CAGUACUUUUGUGUAGUA CAA-3’； miR-449b模擬物正義鏈為5’-AGG CAGUGUUGUUGUUAGCUGGC-3’，反義鏈為5’-CAGCUAACAACACUGCCUUU-3’；miR-449b陰性對照正義鏈為5’-UUCUCCGAA CGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’。用Opti-MEM無血清溶液重懸分離的DC并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，以每孔400 μl體積重懸細(xì)胞種于24孔板中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中適應(yīng)性培養(yǎng)8 h。取50 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基加入無酶EP管中，并加入相應(yīng)濃度的FAM-miRNA混勻靜止5 min。同時(shí)，取另一個(gè)無酶EP管加入50 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，再加入相應(yīng)濃度Lipofectamine 2000 [合成的miR（20 μm）與lip比例為1 ∶ 1]。將兩種物質(zhì)在一個(gè)EP管中混勻并室溫靜止20 min后加入到相應(yīng)孔板中。培養(yǎng)12 h后收取細(xì)胞，冷PBS清洗兩次，流式分析儀及熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染率，調(diào)整Lipofectamine 2000與相應(yīng)miR量取得最佳轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染非熒光標(biāo)記miR-NC、miR-449b、In-miR-NC、In-miR-449b后，收取細(xì)胞，qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后miR-449b在DC中的變化。

1.3.2miR-449b對DC表面分子表達(dá)及DC凋亡的影響按上述方法取最佳混合比例的Lipofectamine 2000與相應(yīng)非熒光修飾miRNA加入到24孔板中，培養(yǎng)12 h后取上清300 μl，并加入含15%FBS的培養(yǎng)基，調(diào)整最終培養(yǎng)基中HMGB1濃度為100 ng/ml，培養(yǎng)48 h后收取DC，檢測表面分子水平及凋亡改變。

1.3.3小鼠CD4＋T細(xì)胞的分選及純度、活性檢測分離小鼠單個(gè)核細(xì)胞后，采用CD4＋T細(xì)胞分選試劑盒分選CD4＋T細(xì)胞，流式分析儀檢測CD4＋T細(xì)胞純度，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性。

1.3.4混合型淋巴細(xì)胞反應(yīng)取不同轉(zhuǎn)染組HMGB1刺激培養(yǎng)48 h的DC與ConA活化12 h后的CD4＋T細(xì)胞以1∶50、1∶100及1∶200比例混合，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞、200 μl含 10%FBS的1640培養(yǎng)基接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)68 h后每孔吸取100 μl上清，加入10 μl CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下檢測各組吸光度值（A值）。收取細(xì)胞上清液，按照ELISA說明書檢測IFN-?和IL-4水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以±s表示，行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1HMGB1對DC表面分子表達(dá)及DC凋亡的影響HMGB1對DC表面分子表達(dá)的量效研究中以100 ng/ml HMGB1的上調(diào)作用最為明顯，而1 000 ng/ml組DC表面分子表達(dá)有所下降。與未加HMGB1刺激組比較，HMGB1刺激48 h后CD80、CD86及MHC-II表達(dá)明顯增加（P＜0.05），以100 ng/ml HMGB1組表面共刺激分子上調(diào)最為明顯（P＜0.05）。以不同濃度HMGB1刺激DC 48 h，隨著HMGB1劑量的增加，DC凋亡率逐漸升高（P＜0.05）。見圖1。

2.2HMGB1刺激DC 48 h后miR-449b的變化HMGB1刺激DC 48 h后，miR-449b表達(dá)量與未刺激組相比明顯增多，且隨著劑量的加大miR-449b表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。流式細(xì)胞分析及細(xì)胞狀態(tài)學(xué)觀察證實(shí)，miRNA 80 nmol/ml時(shí)轉(zhuǎn)染率高及細(xì)胞狀態(tài)良好，并確定In-miR-449b濃度為120 nmol/ml，濃度更高時(shí)細(xì)胞死亡明顯增多。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染12 h后流式分析檢測轉(zhuǎn)染率為63.6%，轉(zhuǎn)染組熒光顯微鏡可見明顯的熒光信號，qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染miR-449b mimics組與對照組的相對比值為245.00±99.24，而轉(zhuǎn)染In-miR-NC組miR-449b與對照組的比值為0.53±0.17。見圖2。

圖1不同劑量HMGB1刺激DC 48 h后表面分子表達(dá)及DC凋亡的改變

2.3miR-449b促進(jìn)DC表面分子CD86表達(dá)及DC凋亡 轉(zhuǎn)染miR-449b并HMGB1刺激48 h后，miR-449b組與miR-NC組相比DC表面分子CD86表達(dá)明顯上調(diào)（22.57±0.82 比15.66±1.32，P＜0.01），In-miR-449b組與In-miR-NC組相比有所降低（14.97±1.34 比17.55±0.71，P＜0.05），miR-449b組與In-miR -449b相比顯著上調(diào)（P＜0.01），而In-miR-449b與各組相比CD80及MHC-II表達(dá)的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染miR-449b 組與miR-NC相比，DC凋亡率明顯增高[（55.63±2.72）%比（67.01± 3.31）%，P＜0.05）]，In-miR-449b組與In-miRNC組相比凋亡明顯減少[（52.47±3.71）% 比（43.91±1.86）%，P＜0.05）]，miR-449b 組與In-miR-449b組相比凋亡增多（P＜0.01）。見圖3。

2.4miR-449b抑制DC對T細(xì)胞的增殖作用轉(zhuǎn)染miR-449b與In-miR-449b的DC分別與T細(xì)胞按1∶50、1∶100及1∶200的比例共培養(yǎng)72 h，其中1∶100比例對T細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)。1∶100時(shí) miR-449b組（0.553±0.014）與 miR-NC（0.624±0.016）相比增殖活性明顯減弱（P＜0.01）；In-miR-449b組（0.739±0.010）與 In-miRNC組（0.626±0.017）相比增殖活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；In-miR-449b組（0.739±0.010）與miR-449b組（0.553±0.014）相比增殖活性明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。見圖4。

2.5miR-449b對共培養(yǎng)上清中IFN-?及IL-4水平的影響miR-449b組與miR-449b-NC組相比，IL-4水平明顯升高[（359.83±22.79）pg/ml比 （308.16±17.87）pg/ml，P＜0.01）]、IFN-?水平明顯下降[（9.92±2.78）pg/ml比（19.10±1.95）pg/ml，P＜0.05）]；In-miR-449b組 與In-miRNC組相比，IL-4水平顯著下降[（275.66±18.28）pg/ml 比 （318.88±5.83）pg/ml，P＜0.01）]、IFN-?水平則明顯升高[（30.57±4.40 ）pg/ml比（19.58±1.40）pg/ml，P＜0.01）]。見圖4。

圖2 不同劑量HMGB1作用于DC 48 h后miR-449b表達(dá)及qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染率情況

圖3 miR-449b對DC表面分子表達(dá)（A）及DC凋亡（B）的影響

3　討 論

近年來資料提示，以T細(xì)胞、DC凋亡增多及繼發(fā)性免疫功能受損為特點(diǎn)的免疫功能紊亂在膿毒癥發(fā)生機(jī)制中具有重要作用[10]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，晚期炎癥介質(zhì)HMGB1可導(dǎo)致T細(xì)胞及DC免疫功能抑制，這可能是感染后機(jī)體免疫功能紊亂的重要調(diào)控機(jī)制[4]。DC作為連接固有免疫及適應(yīng)性免疫的橋梁，其功能及數(shù)量改變在膿毒癥免疫障礙及炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。據(jù)報(bào)道，膿毒癥患者外周血及淋巴器官或組織中均出現(xiàn)DC減少，且健存的DC表現(xiàn)為免疫功能受損[12-14]；而抑制膿毒癥小鼠DC凋亡或者體內(nèi)輸注正常的DC能明顯改善膿毒癥動(dòng)物預(yù)后[15-16]。HMGB1可促進(jìn)DC的成熟及活化，隨著劑量的增加則導(dǎo)致DC成熟障礙及誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2分化，但其確切調(diào)控機(jī)制仍未澄清[4]。業(yè)已明確，miRNA在DC的成熟、分化及凋亡中具有重要作用[7]。有資料證實(shí)，與iDC相比，miR-449b在mDC及tDC中表達(dá)上調(diào)，且鈣離子內(nèi)流可促進(jìn)其在T細(xì)胞中表達(dá)[8-9]。此外，HMGB1對DC免疫功能具有誘導(dǎo)活化及耐受的雙向性，本研究中我們進(jìn)一步探討DC在HMGB1刺激下miR-449b的變化規(guī)律及其對DC免疫功能與凋亡的潛在影響。

圖4　轉(zhuǎn)染miR-449b后DC對T細(xì)胞增殖(A)及細(xì)胞因子IL-4(B)和IFN-γ(C)的影響

miR-449b在HMGB1刺激DC 48 h后表達(dá)上調(diào)，以100及1 000 ng/ml HMGB1組最為明顯，這可能與DC在HMGB1刺激下成熟、免疫功能受損及逐漸凋亡有關(guān)。Stumpfova等[8]觀察到，人外周血來源的DC在誘導(dǎo)成熟及耐受后miR-449b均表現(xiàn)為上調(diào)，與HMGB1刺激DC后miR-449b的變化具有一致性。我們以前關(guān)于HMGB1對DC免疫功能的時(shí)效研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量組HMGB1在48 h時(shí)對DC的免疫功能改變最明顯[17]。本組資料提示HMGB1對DC免疫功能的影響在48 h時(shí)以100 ng/ml最為明顯，因此我們重點(diǎn)分析轉(zhuǎn)染miR-449b后DC在HMGB1刺激48 h后免疫功能的改變。

轉(zhuǎn)染miR-449b、In-miR-449及相應(yīng)對照（miR-NC、In-miR-NC）發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-449b后DC表面分子CD86明顯上調(diào)，而CD80及MHC-II變化不明顯。CD80及CD86作為DC重要的表面共刺激分子，其表達(dá)水平對T細(xì)胞向Th1或Th2分化具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷DC CD80后，在混合性淋巴細(xì)胞反應(yīng)中呈現(xiàn)Th1細(xì)胞低反應(yīng)性或無能，而Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4增多；但阻斷DC的CD86后，Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-?明顯升高[18]。另據(jù)報(bào)道，衰竭的DC與活化的DC相比，CD86與CD80的比值更高，說明CD86具有促進(jìn)T細(xì)胞向Th2分化的作用[19]。新近有人發(fā)現(xiàn)，miR-449b可靶向作用于HDAC的mRNA，從而間接促進(jìn)IFN-β的生成[20]，而IFN-β能促進(jìn)DC表面分子CD86的表達(dá)[21]。有鑒于此，我們推測DC中miR-449b的上調(diào)可能通過影響IFN-β的生成進(jìn)而影響CD86的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞向Th2分化及免疫活性降低。

本組資料證實(shí)，過表達(dá)miR-449b可導(dǎo)致DC凋亡明顯增多，而抑制miR-449b表達(dá)可減少DC的凋亡率。miR-449b對DC凋亡影響的具體機(jī)制還未完全了解。據(jù)報(bào)道，miR-449b過表達(dá)能促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的凋亡，抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞及甲狀腺癌細(xì)胞的增殖分化，其分子機(jī)制與負(fù)性調(diào)控E2F及促進(jìn)P53的活化有關(guān)[22-24]。在膿毒癥病理過程中，DC發(fā)生明顯快速的凋亡，這可能與抗原相關(guān)分子模式（PAMP）和損傷相關(guān)分子模式（DAMP）對DC的作用有關(guān)。人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化來的DC在誘導(dǎo)成熟及耐受后均表現(xiàn)為miR-449b表達(dá)上調(diào)[8]。我們的結(jié)果顯示，DC在高劑量HMGB1刺激下miR-449b明顯上調(diào)，且過表達(dá)miR-449b明顯促進(jìn)DC的凋亡，因此HMGB1刺激下miR-449b的上調(diào)可能參與了膿毒癥中DC的凋亡過程。

進(jìn)一步分析可見，轉(zhuǎn)染miR-449b 的DC經(jīng)HMGB1活化后與轉(zhuǎn)染In-miR-449b組相比，能明顯抑制T細(xì)胞的增殖，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中IL-4水平增高、IFN-?降低。該效應(yīng)可能與miR-449b上調(diào)DC共刺激分子CD86及促進(jìn)DC凋亡有關(guān)，CD86與CD80比值的增大及凋亡DC均可誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2分化。但是否與DC產(chǎn)生IL-12、IL-10等炎癥因子有關(guān)，尚需要深入研究。由此可見，DC中miR-449b增加可誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫功能受抑。

DC免疫功能及凋亡改變是膿毒癥免疫功能紊亂發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，因此深入了解膿毒癥中影響DC功能及凋亡的因素對改善患者預(yù)后可能具有重要意義。業(yè)已明確，HMGB1可誘導(dǎo)DC的成熟及表型功能的異常，但其確切分子機(jī)制仍未清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，DC在HMGB1刺激48 h后miR-449b明顯上調(diào)，可促進(jìn)DC凋亡及誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2分化，從而負(fù)性調(diào)節(jié)DC的免疫功能。同時(shí)，抑制miR-449b后經(jīng)HMGB1刺激的DC凋亡明顯減少，刺激T細(xì)胞增殖效應(yīng)顯著增強(qiáng)。因此，調(diào)節(jié)miR-449b可調(diào)控DC的免疫功能，進(jìn)而有助于深入了解HMGB1對DC影響的分子機(jī)制及其潛在干預(yù)途徑。

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Regulatory effect of microRNA-449b on high mobility group box-1 -mediated immune function of dendritic cells

Wang Yongtao*, Dong Ning, Chai Yanfen, Yu Yan, Qi Anlong, Yao Yongming. *
Department of Emergency, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China Corresponding author∶ Yao Yongming( E-mail∶ c_ff@sina.com)

Objective: To investigate the changes in miR-449b in dendritic cells (DCs) stimulated by high mobility group box-1 protein (HMGB1) and its potential effect on DC-mediated immunity. Methods: CD11c+DCs isolated from mouse spleens were treated with different doses of HMGB1 (10, 100, and 1000 ng/ml) for 48 hours, and then, the expressions of costimulatory molecules, including CD80, CD86, and MHC-II, and miR-449b in DCs were determined, and apoptosis of DCs stimulated by different doses ofHMGB1 were analyzed with flow cytometry. After DCs were transfected with miR-449b mimics (miR-449b), negative control mimics (miR-NC), miR-449b inhibition (In-miR-449b), and negative control inhibition (In-miR-NC), DCs were challenged by HMGB1 (100 ng/ml) for 48 hours. The expressions of co-stimulatory molecules on DC surface and cell apoptosis were analyzed. Moreover, the activated DCs were assessed for their capacity to stimulate the proliferation and differentiation of T cells. Results: The co-stimulatory molecule expressions were markedly up-regulated after DCs were treated with HMGB1 for 48 hours, especially in 100 ng/ml HMGB1 stimulation group, on the other hand, they decreased after DCs were treated with 1000 ng/ml HMGB1. The expression of miR-449b in DCs was enhanced after being stimulated by 100 and 1000 ng/ml HMGB1 for 48 hours (P＜0.05). The percentage of apoptosis was elevated with the increase in the dose of HMGB1 at 48 hours (P＜0.05). The expression of miR-449b in DCs was up-regulated after miR-449b transfection and inhibited by In-miR-449b tranfection. Meanwhile, miR-449b transfection and 100 ng/ml HMGB1 stimulation (48 hours) could significantly up-regulate the expression levels of CD86 (P＜0.05) , while apoptosis of DC was promoted, proliferative effect weakened (P＜0.01), showing an increased level of IL-4 and the decreased level of IFN-γ .Conclusions: MiR-449b might negatively regulate the immune function of DC stimulated by HMGB1 and promote the apoptosis of DC. Thus, miR-449b might play a potential role in down-regulation of host immune response.

miR-449b Dendritic cellHigh mobility group box-1 protein Immune function

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 04. 003

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81130035, 81372054, 81501664)；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB518102)

姚詠明，研究員，教授（E-mail∶ c_ff@sina.com）

2015-11-16)