傅行禮，鞠愛萍，馬小蘭，葉軍

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.山東省鄒城市人民醫(yī)院，山東 鄒城 273500；3.江蘇省泰州市中醫(yī)院，江蘇 泰州 225300；4.江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

·論著·

重組人RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物12-Fc融合蛋白載體的構(gòu)建和表達(dá)*

傅行禮1，鞠愛萍2，馬小蘭3，葉軍4

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.山東省鄒城市人民醫(yī)院，山東 鄒城 273500；3.江蘇省泰州市中醫(yī)院，江蘇 泰州 225300；4.江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

目的用pIRES2-EGFP-Fc載體構(gòu)建重組人RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物12（MED12）-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞表達(dá)MED12-Fc融合蛋白，純化和鑒定MED12-Fc。方法根據(jù)GenBank中的序列信息，從基因組上擴(kuò)增出人MED12基因第2、3和4外顯子，并通過Overlap聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）拼接獲得目的基因片段，以pIRES2-EGFP-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒為載體，構(gòu)建重組人MED12-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒。使用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h收集上清液，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）鑒定質(zhì)粒的表達(dá)能力。表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞，通過G418抗性篩選及流式細(xì)胞儀熒光篩選，獲得高表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。使用穩(wěn)定細(xì)胞株培養(yǎng)表達(dá)人MED12-Fc融合蛋白，收集上清液，用Proein A親和純化柱純化蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）檢測蛋白質(zhì)分子量。結(jié)果通過DNA測序和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)鑒定，證實(shí)MED12第2、3和4外顯子基因序列正確，成功獲得重組人MED12-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)化、G418及流式細(xì)胞儀熒光篩選，獲得高表達(dá)重組人MED12-Fc的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。通過細(xì)胞培養(yǎng)，親和層析純化，獲得高純度的重組人MED12-Fc融合蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建MED12-Fc融合蛋白的表達(dá)載體，獲得高純度的重組人MED12-Fc融合蛋白，為進(jìn)一步研究MED12蛋白功能奠定基礎(chǔ)。

RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物12；融合蛋白；表達(dá)載體

RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物12（mediator of RNA polymeraseⅡtranscription 12，MED12）是中介體復(fù)合物（mediator complex）的一個(gè)亞基，在真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，并參與受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）、核受體（nuclear receptor，NR）和Wnt信號(hào)通路[1-2]。MED12分子的進(jìn)化保守區(qū)域具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，但是MED12基因序列上也存在突變熱點(diǎn)，該位點(diǎn)的突變會(huì)對MED12蛋白的功能產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)將MED12第2、3和4外顯子通過Overlap聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）拼接獲得目的基因片段，以pIRES2-EGFP-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒為載體，構(gòu)建重組人MED12-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，獲得MED12-Fc融合蛋白，為進(jìn)一步開展MED12蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1載體與細(xì)胞pIRES2-EGFP-Fc真核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存，該載體含有hCMV啟動(dòng)子、高效信號(hào)肽序列，以及人IgG1從鉸鏈區(qū)到CH3的Fc片段，可引導(dǎo)外源蛋白融合分泌表達(dá)。同時(shí)，該載體中含有Neo篩選基因、內(nèi)核糖體進(jìn)入序列（internal ribosome entry site，IRES）雙表達(dá)元件、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent pro tein，EGFP），可進(jìn)行G418篩選及熒光檢測和篩選，人腎上皮293T細(xì)胞、CHO細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2儀器與試劑臺(tái)式離心機(jī)購自德國Ependorf公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，PCR儀購自美國Application Binary Interface公司，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、酶標(biāo)版購自美國康寧公司，酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司，電穿孔儀、電擊杯購自美國Bio-Rad公司，PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、組織基因組抽提試劑盒購自美國Axygen公司，HindⅢ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶等分子生物學(xué)產(chǎn)品購自美國Fermentas公司，DH5a感受態(tài)細(xì)胞、溶菌肉湯（luria-bertani，LB）培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)平板等均由本實(shí)驗(yàn)室制作，所用基礎(chǔ)試劑包括蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、NaCl、卡那霉素、G418、西班牙瓊脂糖等購自上海生工生物工程股份有限公司，高效轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 CD、無動(dòng)物來源組分的培養(yǎng)液Optipro無血清培養(yǎng)基（serum free medium，SFM）、Hybridoma-SFM、胰蛋白酶等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國Invitrogen公司，無熱源內(nèi)毒素抽提試劑盒、內(nèi)毒素檢測試劑盒（美洲鱟試劑）、鄰苯二胺購自美國Sigma公司，MED12單抗購自美國Novacell公司，人IgG1酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）Kit（Cat#ab100548）購自美國Abcam公司。

1.1.3基因序列與引物設(shè)計(jì)GenBank中查詢MED12基因信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增第2、3和4外顯子的Overlap PCR引物。使用Primer Premier 5軟件，設(shè)計(jì)Overlap PCR引物，并添加克隆位點(diǎn)。引物由南京金思瑞生物科技有限公司合成。MED12-正向引物1：CTCTAAAGCTTCGATGAACTGACGGCCTTGAA，MED12-反向引物1：AGTTGGAACTGATCTTGGCAG GATTGAAGCTGA；MED12-正向引物2：ATCCTGCC AAGATCAGTTCCAACTTCAGCAG，MED12-反向引物2：TGAAAATGGGGACCTTTTTGGCTAGTTGCGTGA；MED12-正向引物3：TAGCCAAAAAGGTCCCCA TTTTCAGTAAGAAG，MED12-反向引物3：CTCTGG GATCCATGAAAGGGTCAACATGTCT。

1.2方法

1.2.1MED12基因第2、3和4外顯子PCR擴(kuò)增采集健康人抗凝血1 ml，使用美國Axygen公司的血液基因組抽提試劑盒，按照說明書操作步驟對樣本進(jìn)行基因組抽提。在50μl的PCR反應(yīng)體系中，分別加基因組模板5μl、雙蒸水37μl、10×pfu Buffer 5μl、2.5 mmol dNTP 1μl、正向引物（50 pmol）0.5μl、反向引物（50 pmol）0.5μl、pfu高保真DNA聚合酶1μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。以從基因組上擴(kuò)增獲得的第2、3和4外顯子PCR產(chǎn)物為模板（混合），Overlap PCR擴(kuò)增MED12第2、3和4外顯子全長。

1.2.2MED12-Fc真核表達(dá)載體的構(gòu)建①載體與PCR產(chǎn)物的酶切：根據(jù)美國Fermentas公司提供的雙酶切條件，分別對pIRES2-EGFP-Fc載體、MED12-PCR產(chǎn)物進(jìn)行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，37℃水浴反應(yīng)2 h。使用美國Axygen公司的DNA回收試劑盒，對酶切載體和PCR產(chǎn)物做純化回收。②載體與基因的連接、轉(zhuǎn)化DH5a：根據(jù)美國Fermentas公司T4 DNA連接酶說明書配置如下：10×T4 DNA連接酶Buffer 2μl、載體2μl、片段5μl、T4 DNA連接酶2μl，用雙蒸水補(bǔ)足至20μl。將反應(yīng)液混勻后22℃連接30 min，取10μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴10 min。42℃熱激90 s，再冰浴2 min，加入700μl已滅菌的LB培養(yǎng)基。37℃震蕩培養(yǎng)30 min后，均勻涂布含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)過夜。③MED12-Fc陽性克隆的篩選和鑒定：挑取單菌落，用引物MED12-F1/MED12-R3進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出陽性克隆。將陽性克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。抽提好的陽性克隆質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技公司測序，進(jìn)行序列比對。

1.2.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染驗(yàn)證MED12-Fc真核表達(dá)載體的表達(dá)①待轉(zhuǎn)染細(xì)胞預(yù)處理：用Hybridoma-SFM培養(yǎng)和傳代293T細(xì)胞，將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞用胰酶消化后稀釋至4×105個(gè)/ml，鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔500μl。37℃培養(yǎng)約1 d，當(dāng)細(xì)胞貼壁面匯合至90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。②DNA預(yù)處理：使用Sigma公司的無熱源內(nèi)毒素抽提試劑盒抽提MED12-Fc表達(dá)質(zhì)粒，取1μg質(zhì)粒加入50μl Optipro SFM混勻，將2μl LipofectamineTM2000 CD轉(zhuǎn)染試劑混勻后室溫孵育20min。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物50μl滴加至24孔板中，混勻后37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。④ELISA檢測培養(yǎng)上清液：取瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)上清液，用Abcam雙抗夾心法ELISA檢測試劑盒做檢測，鄰苯二胺顯色后酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.2.4MED12-Fc穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的建立①CHO細(xì)胞預(yù)處理：用含10%血清的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium:nutrient mixture F-12，DMEM/F12）培養(yǎng)和傳代CHO細(xì)胞。將處于對數(shù)生長期的CHO細(xì)胞用胰蛋白酶消化后稀釋至2×106個(gè)/ml。②MED12-Fc表達(dá)質(zhì)粒的酶切處理：取5μg MED12-Fc表達(dá)質(zhì)粒，加3μlBstBⅠ限制性內(nèi)切酶過夜。取100 ng酶切后的質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切是否完全。③電轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，G418結(jié)合流式細(xì)胞儀熒光篩選穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株：取2μg酶切線性的質(zhì)粒與50μl CHO細(xì)胞懸液混勻，加入2 mm電擊杯中，設(shè)定電穿孔儀電壓800 V，電容25μF，電擊時(shí)間10 ms，電穿2次。電穿后電擊杯在冰上靜置10 min，移液管轉(zhuǎn)移細(xì)胞至含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的10 cm培養(yǎng)皿。2 d后待細(xì)胞生長狀態(tài)恢復(fù)，用600μg/ml G418對陰性細(xì)胞進(jìn)行殺滅。觀察細(xì)胞狀態(tài)，4 d換培養(yǎng)液1次，2周后用流式細(xì)胞儀分選出特別高熒光強(qiáng)度的細(xì)胞，并用極限稀釋法種入96孔培養(yǎng)板。最終通過ELISA檢測，篩選得到穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞株。

1.2.5MED12-Fc融合蛋白的表達(dá)與純化①M(fèi)ED12-Fc融合蛋白穩(wěn)定細(xì)胞株的培養(yǎng)：選用1L的滾瓶連續(xù)培養(yǎng)，24 h后開始收集培養(yǎng)上清液，更換培養(yǎng)液。②MED12-Fc融合蛋白的純化：將培養(yǎng)上清液用0.22μm濾膜過濾，濾液以1 ml/min的流速通過Protein A層析柱（購自美國通用電氣公司），1×磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=7.4）洗滌層析柱，甘氨酸（pH=2.5）洗脫融合蛋白，PBS（pH=7.4）透析得到純品融合蛋白。③MED12-Fc融合蛋白的檢測：取純品融合蛋白做十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測。④蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)鑒定MED12-Fc融合蛋白：MED12-Fc融合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)凝膠上的蛋白至硝酸纖維膜上，牛血清白蛋白封閉膜，用堿性磷酸酶標(biāo)記的特異性抗人IgG-Fc的單克隆抗體（美國Jackson公司）進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白購自南京金思瑞生物公司（貨號(hào)：M00124）。

2 結(jié)果

2.1MED12基因第2、3和4外顯子的PCR擴(kuò)增

以健康人外周血基因組為模板，PCR擴(kuò)增MED12基因第2、3和4外顯子分別為105、192和156 bp（見圖1）。以擴(kuò)增的3個(gè)片段為模板，MED12-正向引物1、MED12-反向引物3為首尾引物，Overlap PCR擴(kuò)增MED12第2、3、4外顯子全長453 bp（見圖2）。

圖1 MED12基因第2、3和4外顯子的PCR擴(kuò)增

圖2 Overlap PCR擴(kuò)增MED12基因第2、3和4外顯子全長

2.2陽性克隆的篩選和鑒定

挑取單菌落，用引物MED12-正向引物1/ MED12-反向引物3進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳（見圖3）。抽提好的陽性克隆質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技公司測序，經(jīng)序列比對，序列完全正確，測序峰圖見圖4。最終，成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒為載體，得到重組人MED12-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒（見圖5）。

圖3 陽性克隆的篩選

圖4 MED12-Fc真核表達(dá)載體測序峰圖

2.3流式細(xì)胞儀熒光篩選穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株

2周后用流式細(xì)胞儀分選出其中高熒光強(qiáng)度的細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。見圖6。

2.4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染驗(yàn)證MED12-Fc真核表達(dá)載體的表達(dá)

取瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)上清，按照Abcam ELISA雙抗夾心法檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，經(jīng)鄰苯二胺顯色后酶標(biāo)儀讀數(shù)測定，構(gòu)建的MED12-Fc真核表達(dá)載體具有很高的表達(dá)能力，表達(dá)量為7.5 mg/L。

圖5 pIRES2-EGFP-Fc載體重組人MED12-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒示意圖

圖6 流式細(xì)胞儀篩選穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞

2.5MED12-Fc融合蛋白的檢測

取純品融合蛋白做聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，未還原的融合蛋白分子量為60～70 kD，經(jīng)過二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）還原后，分子量約為30～40 kD。綜合糖基化因素，與預(yù)測值相符。見圖7。

圖7 MED12-Fc融合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.6蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)鑒定MED12-Fc融合蛋白

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，還原和未還原的融合蛋白都出現(xiàn)條帶，且分子量與預(yù)期相符。見圖8。

圖8 MED12-Fc融合蛋白的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

3 討論

MED12在所有真核生物細(xì)胞中表達(dá)，哺乳動(dòng)物中，MED12基因定位于X染色體上[3]。人的MED12基因由45個(gè)外顯子構(gòu)成，跨度為25 kb并含有豐富的GC重復(fù)序列。MED12的轉(zhuǎn)錄活性與發(fā)育過程和組織分布相關(guān)。MED12由2 212個(gè)氨基酸組成，分為4個(gè)區(qū)域：①C-末端亮氨酸豐富的區(qū)域；②亮氨酸、絲氨酸豐富的區(qū)域（5’-LS）；③脯氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸豐富的區(qū)域（PQL）；④Opa區(qū)域。研究認(rèn)為MED12基因的5’-LS和PQL區(qū)域序列高度一致，而Opa區(qū)域序列相似性較差。目前對5’-LS和PQL區(qū)域功能的研究尚不明確，該區(qū)可能參與介導(dǎo)MED12與中介體復(fù)合物的聯(lián)系；Opa區(qū)域則可能與Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[1]。MED12在Wnt家族基因編碼的糖蛋白細(xì)胞周期、細(xì)胞極性和遷移中發(fā)揮重要作用[2]。

MED12可以與不同的因子相互作用，調(diào)節(jié)生物活性。轉(zhuǎn)錄因子Nanog對胚胎干細(xì)胞多能性的維持起關(guān)鍵作用，MED12通過對Nanog基因的表達(dá)調(diào)控，激活或抑制轉(zhuǎn)錄依賴于啟動(dòng)子與細(xì)胞分化的狀態(tài)[4]。MED12還參與Wnt信號(hào)通路。MED12可以與Wnt通路中的中心分子β-catenin相互作用，實(shí)現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。通路激活后，β-catenin從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核，MED12與中介體復(fù)合作用，激活下游基因的表達(dá)。MED12的功能不僅限于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中MED12與轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）R2抑制糖基化的不成熟相關(guān)，降低細(xì)胞質(zhì)中TGF-βR2的水平[5]。最近較多的臨床研究顯示，子宮平滑肌瘤、子宮間質(zhì)腫瘤、前列腺癌中存在MED12基因突變[6-11]。PéROT等[12]報(bào)道，所有典型的平滑肌瘤中都有MED12基因蛋白表達(dá)，而40%非典型平滑肌瘤、50%惡性潛能未定的子宮平滑肌腫瘤和80%平滑肌肉瘤無MED12蛋白表達(dá)，推測MED12的存在與突變可能會(huì)抑制惡性腫瘤的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)將克隆的MED12基因第2、3、4外顯子片段與IgG的Fc片段連接起來。耦聯(lián)的IgG Fc片段不僅可以發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，如抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、激活補(bǔ)體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用，而且可以顯著延長蛋白的半衰期。其可方便地通過protein A或protein G純化，用抗人Fc片段抗體標(biāo)記物可識(shí)別融合蛋白的Fc片段，從而鑒定融合蛋白識(shí)別的組織和細(xì)胞。目前有大量商品化的抗人IgG Fc二抗，融合蛋白中的Fc片段可使目的蛋白易于進(jìn)行同位素標(biāo)記和酶標(biāo)記，從而進(jìn)行檢測。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒為載體，構(gòu)建重組人MED12-Fc真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。夾心法ELISA結(jié)果證實(shí)該融合蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)上清中呈分泌性表達(dá)。SDS-PAGE檢測表明，融合蛋白的相對分子質(zhì)量同預(yù)期結(jié)果一致。pIRES2-EGFP-Fc重組載體的構(gòu)建及MED12-Fc融合蛋白的成功表達(dá)為下一步檢測MED12-Fc融合蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

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（申海菊 編輯）

Construction and expression of a recombinant fusion protein plasmid containing extracellular domain of human mediator of RNA polymeraseⅡtranscription 12 and Fc fragment*

Xing－li FU1,Ai－ping JU2,Xiao－lan MA3,Jun YE4
(1.Medical College,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212001,P.R.China;2.The People's Hospital of Zoucheng,Zoucheng,Shandong 273500,P.R.China;3.Hospital of Traditional Chinese Medicine of Taizhou City,Taizhou,Jiangsu 225300,P.R.China;4.The People's Hospital of Taizhou,Taizhou,Jiangsu 225300,P.R.China)

【Objective】To construct eukaryotic expression plasmid of recombinant human mediator of RNA polymeraseⅡtranscription 12(MED12)－Fc using the pIRES2－EGFP－Fc vector and express the fusion protein of MED12－Fc in CHO cells,finally to purify and characterize it.【Methods】According to the information in GenBank,the sequence of exons 2～4 of human MED12 gene was amplified from the genome.The target fragment was obtained by Overlap PCR and splicing and then inserted into the pIRES2－EGFP－Fc vector.Recombinant expression vector MED12－Fc was constructed and evaluated by DNA sequencing.The plas－mid of MED12－Fc was transiently transfected into 293T cells using lipofectin reagent for 48 h.Then,the supernatant was collected and detected with enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit.The expression plasmid was transfected into CHO cells by electroporation,and the positive clone with high expression of fusion protein was selected through G418 resistant selection and flow cytometric fluorescence screening.The fusion protein secreted from positive clone was purified by protein－A affinity chromatography.The purified product was analyzed by SDS－PAGE.【Results】DNA sequencing and expression of transient transfection indicated the sequence of exons 2～4 of MED12 gene was correct and MED12－Fc was successfully constructed. The positive clone with high－expression fusion protein was obtained by electroporation,G418 resistant selection and flow cytometric fluorescence screening.The high－purity fusion protein was obtained by cell culture and protein A affinity chromatography.【Conclusions】The eukaryotic expression vector MED12－Fc has been successfully constructed and the high－purity MED12－Fc fusion protein has been obtained,which lay a foundation for further exploration of biological activity of MED12 protein.

mediator of RNA polymeraseⅡtranscription(MED)12;fusion protein;eukaryotic expression vector

Q782

A

1005-8982（2015）32-0014-06

2015-07-13

江蘇省衛(wèi)生廳面上項(xiàng)目（No：H201456）；泰州市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（No：TS2013009）

葉軍，E-mail：yejun@gotofcm.com；Tel：13625171902