李思維 牛國(guó)棟 劉忠軍 宋純理 張克冷慧杰

（北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京100191）

·基礎(chǔ)研究·

1α,25(OH)2D3調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原降解的實(shí)驗(yàn)研究*

李思維 牛國(guó)棟 劉忠軍 宋純理 張克**冷慧杰**

（北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京100191）

背景：維生素D代謝水平與關(guān)節(jié)炎的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議，且維生素D對(duì)關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原代謝的調(diào)控機(jī)制尚不明晰。深入了解維生素D對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨代謝的作用，有助于了解骨關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機(jī)制，為預(yù)防、治療骨關(guān)節(jié)炎提供參考。

目的：在細(xì)胞水平和組織塊水平，探討維生素D對(duì)關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原代謝的調(diào)控作用。

方法：使用炎癥因子OSM和TNF-α誘導(dǎo)軟骨Ⅱ型膠原降解，對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以及牛關(guān)節(jié)軟骨組織塊分別進(jìn)行1α, 25(OH)2D3干預(yù)，通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中Ⅱ型膠原羧基末端肽（CTX-Ⅱ）水平，從而評(píng)估維生素D對(duì)軟骨Ⅱ型膠原代謝的調(diào)控作用。

結(jié)果：1α,25(OH)2D3可以提高未經(jīng)OSM和TNF-α誘導(dǎo)的以及OSM和TNF-α誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞的活性。在細(xì)胞水平，1α,25(OH)2D3對(duì)正常細(xì)胞上清中的CTX-Ⅱ的水平?jīng)]有顯著影響。OSM和TNF-α誘導(dǎo)顯著增加了細(xì)胞上清中CTX-Ⅱ的水平。1α,25(OH)2D干預(yù)降低了OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞上清中CTX-Ⅱ的水平。在組織塊水平，對(duì)于正常軟骨組織塊，1α,25(OH)2D3增加了CTX-Ⅱ水平。OSM和TNF-α誘導(dǎo)顯著增加了體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨組織塊軟骨的降解，細(xì)胞上清中CTX-Ⅱ水平顯著增高。對(duì)于OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨組織塊，1α,25(OH)2D3干預(yù)降低了軟骨組織塊Ⅱ膠原的降解，CTX-Ⅱ水平顯著降低。

結(jié)論：1α,25(OH)2D3能夠抑制OSM和TNF-α誘導(dǎo)的Ⅱ型膠原降解作用。維生素D可能通過(guò)抑制關(guān)節(jié)炎軟骨的降解起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。

維生素D；關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；軟骨組織塊培養(yǎng)；Ⅱ型膠原羧基末端肽

Background:ound:Disagreementon the relationship between vitam in Dmetabolism and osteoarthritis(OA)stillexists in the literatures.Investigating the role of vitam in D in OA cartilagemetabolism w ill help to well understand the etiology and pathogenesisof OA,andw ill contribute to improvement in the prevention and treatmentof OA.

Objective:tive:To investigate themodulation of vitamin D on collagen typeⅡdegradation atcelland tissue levels.

Methods:hods:Rat articular chondrocytes and bovine articular cartilage explantsw ere stimulated by inflammatory factors(OSM and TNF-α)to imitateOA cartilage chondrocytes,thenwere treated by 1α,25(OH)2D3.C term inal fragmentsof typeⅡcollagen(CTX-Ⅱ)expression in supernatantwasmeasured by ELISA to evaluate degradation of collagenⅡ.

Results:ults:At cellular level,the combined effects of OSM and TNF-αincreased CTX-Ⅱ level in supernatant.1α,25(OH)2D3decreased theCTX-Ⅱ levelw hich was induced by OSM plus TNF-α.A t the tissue level,the stimulation of OSM plus TNF-α increased CTX-Ⅱ level in the supernatant.1α,25(OH)2D3increased the CTX-Ⅱ levels in the normal cartilage tissue.1α,25 (OH)2D3decreased CTX-Ⅱlevels in cartilage tissuew ith OSM plus TNF-αstimulation.

Conclusions:ions:1α,25(OH)2D3can inhibit the degradation of collagenⅡin articular chondrocytes stimulated by OSM plus TNF-α.Vitamin Dmay play a protective role in articular cartilage through regulation of cartilage turnover.

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。以關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原纖維降解、蛋白多糖進(jìn)行性耗損為主要特征。關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原纖維降解主要是由于軟骨組織分解代謝和合成代謝的紊亂，打破了軟骨組織的代謝穩(wěn)態(tài)。這種持續(xù)的異常的軟骨組織代謝紊亂導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨分解代謝增加和

關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程的激活，最終形成不可逆的關(guān)節(jié)軟骨破壞和功能障礙[1-3]。

維生素D是一種脂溶性維生素，具有重要的生理作用。研究表明，維生素D缺乏時(shí)可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、佝僂病、軟骨病、糖尿病、心血管疾病、多發(fā)硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，甚至結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等[4-8]。維生素D缺乏（血清25-(OH)D3＜37.5 nmol/L）是一種常見(jiàn)的全球性疾患，尤其是在北半球的國(guó)家和地區(qū)[9]。多項(xiàng)臨床大樣本的流行病研究顯示，低水平血清維生素D3與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[10-12]，但有部分流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)維生素D3水平與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生無(wú)相關(guān)性[13,14]。導(dǎo)致這種爭(zhēng)議的原因可能在于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣、種族等多種因素的影響。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持維生素D對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有積極的保護(hù)作用。有實(shí)驗(yàn)表明維生素受體表達(dá)于人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，這說(shuō)明關(guān)節(jié)軟骨是維生素D的靶組織[15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明25-羥維生素D 1α羥化酶（25-hydroxyvitam in D 1α-hydroxylase）基因敲除直接導(dǎo)致了小鼠顳下頜關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[16]。在維生素D缺乏的情況下，補(bǔ)充維生素D可顯著降低生長(zhǎng)板軟骨膠原酶的活動(dòng)[17]。而膠原酶是導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要酶類(lèi)。維生素D補(bǔ)充也可改善膠原誘導(dǎo)和交叉韌帶離所斷誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎[18,19]。

目前，維生素D對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病和發(fā)展作用的機(jī)理尚不清楚。本研究通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)，旨在從多個(gè)層面探索維生素D在關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原降解中的調(diào)控作用，進(jìn)一步理解維生素D保護(hù)關(guān)節(jié)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑儀器

大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞來(lái)自新生Sprague-Daw ley大鼠，新鮮牛關(guān)節(jié)軟骨來(lái)自北京屠宰場(chǎng)。本研究得到北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器如下：1α,25(OH)2D3（Selleck，美國(guó)）；Ⅱ型膠原酶（Sigma，美國(guó)）；CCK 8試劑盒（Dojindo，日本）；CTX-Ⅱ ELISA試劑盒（HCB，加拿大）；0.25%胰蛋白酶，低糖DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗（Corning，美國(guó)）；制瘤素M（OSM）（Sino Biological，中國(guó)）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（PEPROTRCH，美國(guó)）。

1.2 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

將5只出生24 h內(nèi)的Sprague-Daw ley大鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡5m in后取出。用眼科剪和眼科鑷分離膝關(guān)節(jié)的透明軟骨，放入盛有含有雙抗的PBS培養(yǎng)皿中。剔除殘余的軟組織，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，PBS洗4次，每次2m in，棄上清。洗凈的軟骨塊移入6孔板中，用眼科剪將軟骨塊剪碎，加入約2m l的Ⅱ型膠原酶。用吸管充分吹打混勻后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育2 h，每隔30m in用塑料吸管吹打一次并收取細(xì)胞。加入10%FBS完全培養(yǎng)液終止消化，充分吹打混勻后收集至15m l的離心管中，以800 g/m in的速度，離心5m in，棄上清。加入5m l完全培養(yǎng)基，充分吹打混勻，終止消化，取混懸液分至2個(gè)中皿中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此后隔日換液。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到培養(yǎng)皿底部的80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代[20]。

1.3 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞鑒定

1.3.1 甲苯胺藍(lán)染色：取出細(xì)胞爬片，PBS洗2次，每次5m in。4%多聚甲醛室溫下固定1 h，再以PBS洗2次，每次5m in。加入1%甲苯胺藍(lán)染液，37℃孵育2 h。去除多余的染液，PBS洗2次，每次5m in。最后脫水透明，封片。

1.3.2 Ⅱ型膠原免疫熒光染色：取出細(xì)胞爬片，PBS洗2次，每次5m in。4%多聚甲醛固定10m in，PBS洗2次，每次5m in。PBST（PBS加0.1%TritonX100）通透20～30m in，5%BSA室溫封閉1 h。加入Ⅱ型膠原抗體（稀釋度為1∶200），4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5m in，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗兔二抗（稀釋度為1∶200），室溫避光孵育1 h。PBST洗3次，每次5m in，加入10μg/LDAPI室溫避光孵育5m in。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.4 CCK CCK88法檢測(cè)11α,,2525(OH)(OH)22D D33對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的作用

在96孔板上，每孔種植2.5×104個(gè)軟骨細(xì)胞；過(guò)夜，使細(xì)胞得以黏附、延伸，具體分組及干預(yù)方式如下:①對(duì)照組，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；②無(wú)誘導(dǎo)低劑量組，10 nmol/L 1α,25(OH)2D3；③無(wú)誘導(dǎo)高劑量組，100nmol/L 1α,25(OH)2D3；④誘導(dǎo)組，20 ng/m l TNF-α，10 ng/m l OSM，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑤誘導(dǎo)后低劑量組，20ng/m l TNF-α，10 ng/m lOSM，10 nmol/L 1α, 25(OH)2D3；⑥誘導(dǎo)后高劑量組，20 ng/m l TNF-α，10 ng/m l OSM，100 nmol/L 1α,25(OH)2D3。每組6個(gè)復(fù)孔。5%CO2，37℃孵育，倒置顯微鏡下觀察。24 h后每孔內(nèi)加入CCK-8溶液20μl，繼續(xù)孵育3 h，終止培養(yǎng)。檢測(cè)以上不同濃度的1α,25(OH)2D3作用后各組軟骨細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（OD值）。

1.5 11α,,2525(OH)(OH)22D D33對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的降解作用

在24孔板上，每孔種植5×104個(gè)軟骨細(xì)胞，過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁增殖，具體干預(yù)方式如下：①對(duì)照組，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；②無(wú)誘導(dǎo)低劑量組，10nmol/L 1α,25(OH)2D3；③無(wú)誘導(dǎo)高劑量組，100 nmol/L 1α,25 (OH)2D3；④誘導(dǎo)組，10 ng/m l TNF-α，5 ng/m l OSM，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑤誘導(dǎo)后低劑量組，10 ng/m l TNF-α，5ng/m lOSM，10nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑥誘導(dǎo)后高劑量組，10ng/m l TNF-α，5 ng/m lOSM，100nmol/L 1α,25(OH)2D3。每組3個(gè)復(fù)孔。5%CO2，37℃孵育。24h后收取細(xì)胞上清。檢測(cè)以上不同濃度的1α,25(OH)2D3作用24 h后各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中CTX-Ⅱ的濃度。

1.6 11,,2525(OH)(OH)22D D33對(duì)體外關(guān)節(jié)軟骨組織塊的降解作用

新鮮完整牛膝關(guān)節(jié)軟骨無(wú)菌條件下取材，每組10個(gè)軟骨塊，重量為（14±2）mg。放入含有雙抗的PBS中反復(fù)漂洗3次。然后置于96孔板中，每孔加入200μl低糖-DMEM培養(yǎng)基，具體干預(yù)方式及分組如下：①對(duì)照組，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；②無(wú)誘導(dǎo)低劑量組，10 nmol/L 1α,25(OH)2D3；③無(wú)誘導(dǎo)中劑量組，100 nmol/L 1α,25(OH)2D3；④無(wú)誘導(dǎo)高劑量組，1000 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑤ 誘導(dǎo)組，20 ng/m l TNF-α，10ng/m lOSM，0 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑥誘導(dǎo)后低劑量組，20ng/m l TNF-α，10 ng/m lOSM，10nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑦誘導(dǎo)后中劑量組，20 ng/m l TNF-α，10 ng/m lOSM，100 nmol/L 1α,25(OH)2D3；⑧誘導(dǎo)后高劑量組，20 ng/m l TNF-α，10 ng/m lOSM，1000 nmol/L 1α,25(OH)2D3。組織塊在以上無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，每7 d更換培養(yǎng)液。收集培養(yǎng)液-80°C凍存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)條件下從組織塊釋放的CTX-Ⅱ的水平。本法靈敏度為1 pg/m l。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用One-way Anova檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞鑒定

細(xì)胞在光鏡下呈梭形或者三角形，鏡下呈鋪路石樣表現(xiàn)（圖1A）。甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞后呈藍(lán)色，提示該細(xì)胞表達(dá)蛋白聚糖（圖1B）。細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示所有細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原（圖1C），可以確認(rèn)該細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。

2.2 11α,,2525(OH)(OH)22D D33對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用

與非OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞（對(duì)照組）相比，OSM和TNF-α誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞（誘導(dǎo)組）活性有所下降，但兩組之間并無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖2A）。1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)非OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性具有一定的促進(jìn)作用，但沒(méi)有劑量依賴性（圖2B）。對(duì)于OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，10 nmol/L（誘導(dǎo)后低劑量組）和100 nmol/L（誘導(dǎo)后高劑量組）的1α,25(OH)2D3均可提高軟骨細(xì)胞的活性（圖2C）。

2.3 11α,,2525(OH)(OH)22D D33對(duì)體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的代謝作用

與對(duì)照組相比，OSM和TNF-α誘導(dǎo)顯著增加了軟骨細(xì)胞細(xì)胞Ⅱ型膠原的降解。細(xì)胞上清中CTX-Ⅱ水平顯著增高（P＜0.05，圖3A）。在未經(jīng)OSM和TNF-α誘導(dǎo)的正常軟骨細(xì)胞中，不同劑量1α,25(OH)2D3并未增加其CTX-Ⅱ水平（圖3B）。然而在OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，10 nmol/L和100 nmol/L的1α, 25(OH)2D3均降低了軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的降解（圖3C）。

2.4 11α,,2525(OH)(OH)22D D33對(duì)體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨組織塊的降解作用

圖1 光鏡下及染色后的細(xì)胞形態(tài)觀察

圖2 軟骨細(xì)胞活性檢測(cè)

與對(duì)照組比較，OSM和TNF-α誘導(dǎo)顯著促進(jìn)了體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨組織塊的降解，細(xì)胞上清中CTX-Ⅱ水平顯著增高（P＜0.05，圖4A）。對(duì)于未經(jīng)OSM和TNF-α誘導(dǎo)的正常軟骨細(xì)胞，無(wú)誘導(dǎo)低劑量組1α, 25(OH)2D3干預(yù)對(duì)細(xì)胞上清中CTX-Ⅱ水平?jīng)]有顯著影響。中劑量組和高劑量組1α,25(OH)2D3干預(yù)顯著增加了細(xì)胞上清中CTX-Ⅱ水平（圖4B）。對(duì)于OSM和TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，10、100、1000 nmol/L的1α,25(OH)2D3均降低了軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的降解，CTX-Ⅱ水平顯著降低（圖4C）。

3 討論

本研究探討了維生素D在關(guān)節(jié)炎軟骨代謝中可能發(fā)揮的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論在炎癥因子刺激的軟骨細(xì)胞，還是未經(jīng)刺激的正常軟骨細(xì)胞中，維生素D均能改善軟骨細(xì)胞的活性，這提示維生素D能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。實(shí)驗(yàn)中使用的OSM和TNF-α是兩種在關(guān)節(jié)炎發(fā)生和進(jìn)展中起著重要作用的細(xì)胞因子，二者聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著促進(jìn)軟骨組織的分解代謝[21,22]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞因子OSM和TNF-α處理關(guān)節(jié)軟骨，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨降解。CTX-Ⅱ是軟骨組織Ⅱ型膠原降解的產(chǎn)物，能夠有效地反應(yīng)關(guān)節(jié)炎軟骨的狀況[23,24]，我們使用1α,25(OH)2D3干預(yù)軟骨細(xì)胞并通過(guò)檢測(cè)CTX-Ⅱ評(píng)估軟骨降解情況。

細(xì)胞培養(yǎng)研究和軟骨組織塊培養(yǎng)研究均顯示OSM和TNF-α可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨CTX-Ⅱ的水平顯著上升，提示炎癥性的細(xì)胞因子能夠增加關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的降解作用；并且1α,25(OH)2D3干預(yù)可以顯著抑制OSM和TNF-α所導(dǎo)致的CTX-Ⅱ水平上升。這說(shuō)明1α,25(OH)2D3能夠抑制關(guān)節(jié)炎性的軟骨細(xì)胞高分解代謝狀況，緩解關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。有意思的是，對(duì)于未經(jīng)OSM和TNF-α誘導(dǎo)的正常軟骨細(xì)胞，1α,25(OH)2D3的干預(yù)可以使細(xì)胞上清中CTX-Ⅱ水平升高。這說(shuō)明軟骨細(xì)胞對(duì)維生素D的反應(yīng)性因自身狀態(tài)的改變而改變，關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞可能對(duì)維生素D的反應(yīng)并不一致。這種現(xiàn)象可能提示，正常生理狀態(tài)下1α,25(OH)2D3可以少量增加軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的降解，其機(jī)制不

明，可能這種作用尚處于軟骨基質(zhì)正常的降解、重建、修復(fù)的穩(wěn)態(tài)之中，不足以減少關(guān)節(jié)軟骨量，以致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展。

圖3 軟骨細(xì)胞上清CTX-Ⅱ檢測(cè)

圖4 組織塊釋放的CTX-Ⅱ的檢測(cè)

本研究顯示關(guān)節(jié)軟骨組織塊對(duì)1α,25(OH)2D3的反應(yīng)性與大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基本相似，二者可以相互驗(yàn)證。利用關(guān)節(jié)軟骨組織塊研究維生素D對(duì)關(guān)節(jié)軟骨作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。關(guān)節(jié)軟骨組織塊培養(yǎng)，對(duì)于評(píng)價(jià)維生素D對(duì)軟骨組織的作用有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。一方面，關(guān)節(jié)軟骨組織塊培養(yǎng)可以排除其他因素的影響，如軟骨下骨和滑膜的影響。維生素D是骨質(zhì)疏松治療的藥物之一，它對(duì)軟骨下骨的骨質(zhì)量也有顯著影響。軟骨下骨的力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)的改變?cè)陉P(guān)節(jié)炎的發(fā)病和進(jìn)展中具有重要作用。在需要排除關(guān)節(jié)下骨影響的研究中，關(guān)節(jié)軟骨組織塊培養(yǎng)是較好的選擇。另一方面，關(guān)節(jié)軟骨組織塊培養(yǎng)可以有效地保留了細(xì)胞外基質(zhì)。軟骨組織具有細(xì)胞數(shù)目少，細(xì)胞外基質(zhì)成分多的特點(diǎn)。在骨關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中，軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)降解是關(guān)節(jié)炎的重要病理特征之一，細(xì)胞外基質(zhì)有其重要生理作用。軟骨組織塊培養(yǎng)是一種探討藥物對(duì)軟骨直接作用的良好工具。因此我們選用細(xì)胞體外培養(yǎng)和組織塊體外培養(yǎng)的方法探討維生素D對(duì)軟骨代謝的直接作用。

目前對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機(jī)制仍缺乏足夠的了解，尚未形成一種特效的治療方法。由于骨關(guān)節(jié)炎病程長(zhǎng)，需要長(zhǎng)期使用病情改善性藥物，因此對(duì)藥物的安全性要求很高。理想的骨關(guān)節(jié)炎藥物應(yīng)該具有以下特征：經(jīng)濟(jì)安全，依從性好，能夠改善關(guān)節(jié)炎病情。維生素D容易獲得，經(jīng)濟(jì)，安全性好，患者依從性良好，能夠改善軟骨下骨的骨質(zhì)疏松，同時(shí)具有直接調(diào)控軟骨代謝的作用。因此，維生素D是具有很大的潛力及良好應(yīng)用前景的關(guān)節(jié)炎治療藥物。

[1]van Meurs JB,van LentPL,Holthuysen AE,etal.Kinetics of aggrecanase-andmetalloproteinase-induced neoepitopes in various stages of cartilage destruction inmurine arthritis. A rthritis Rheum,1999,42(6):1128-1139.

[2]Behrens F,Kraft EL,Oegema TR Jr.Biochem ical changes in articular cartilage after joint immobilization by casting or external fixation.JOrthop Res,1989,7(3):335-343.

[3]周新華,王敏,姬顏輝,等.m iRNA-140在早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及功能.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2014, 35(6):610-615.

[4]Bouillon R,CarmelietG,Verlinden L,etal.Vitamin D and human health:lessons from vitamin D receptor nullmice. Endocr Rev,2008,29(6):726-776.

[5]Bikle DD.Vitam in D and immune function:understanding common pathways.Curr Osteoporos Rep,2009,7(2):58-63.

[6]Stoffels K,Overbergh L,Giulietti A,et al.Immune regulation of 25-hydroxyvitam in-D3-1alpha-hydroxy lase in humanmonocytes.JBoneMiner Res,2006,21(1):37-47.

[7]Bartley J.Vitam in D:emerging roles in infection and immunity.ExpertRev Anti Infect Ther,2010,8(12):1359-1369.

[8]Lee JH,O'Keefe JH,BellD,etal.Vitamin D deficiency an important,common,and easily treatable cardiovascular risk factor?JAm CollCardiol,2008,52(24):1949-1956.

[9]Holick MF.Vitam in D deficiency.N Engl JMed,2007,357 (3):266-281.

[10]Ding C,Cicuttini F,Paramesw aran V,et al.Serum levels of vitam in D,sunlightexposure,and knee cartilage loss in old-

er adults:the Tasmanian older adult cohort study.Arthritis Rheum,2009,60(5):1381-1389.

[11]Muraki S,Dennison E,Jameson K,etal.Association of vitamin D statusw ith knee pain and radiographic knee osteoarthritis.OsteoarthritisCartilage,2011,19(11):1301-1306.

[12]Lane NE,Gore LR,Cumm ings SR,etal.Serum vitam in D levels and incident changes of radiographic hip osteoarthritis:a longitudinal study.Study of Osteoporotic Fractures Research Group.A rthritis Rheum,1999,42(5):854-860.

[13]Felson DT,Niu J,Clancy M,etal.Low levelsof vitamin D and worsening of knee osteoarthritis:results of two longitudinal studies.A rthritis Rheum,2007,56(1):129-136.

[14]Hunter DJ,Hart D,Snieder H,et al.Evidence of altered bone turnover,vitamin D and calcium regulation w ith knee osteoarthritis in female tw ins.Rheumatology(Ox ford), 2003,42(11):1311-1316.

[15]Tetlow LC,Woolley DE.Expression of vitamin D receptors and matrix metalloproteinases in osteoarthritic cartilage and human articular chondrocytes in vitro.Osteoarthritis Cartilage,2001,9(5):423-431.

[16]Shen M,Luo Y,Niu Y,etal.1,25(OH)2D3deficiency induces temporomandibular joint osteoarthritis via secretion of senescence-associated inflammatory cytokines.Bone, 2013,55(2):400-409.

[17]David DD,Boyan BD,Schw artz Z,et al.Effect of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and 24R,25-dihydroxyvitamin D3 onmetalloproteinase activity and cellmaturation in grow th plate cartilage in vivo.Endocrine,2001,14(3):311-323.

[18]Castillo EC,Hernandez-Cueto MA,Vega-Lopez MA,etal. Effects of vitam in D supplementation during the induction and progression of osteoarthritis in a ratmodel.Evid Based ComplementAlternatMed,2012,2012:156563.

[19]Cantorna MT.1,25-dihydroxycholecalciferol inhibits the progression of arthritis in murinemodels of human arthritis.JNutr,1998,128(1):68-72.

[20]韋宋譜,張曉鋼,丁道芳,等.一種獲取具有旺盛增殖力的大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法.上海中醫(yī)藥雜志,2012,18(7):8-12.

[21]Oestergaard S,Sondergaard BC,Hoegh-Andersen P,et al. Effects of ovariectomy and estrogen therapy on type IIcollagen degradation and structural integrity of articular cartilage in rats:im plications of the time of initiation.A rthritis Rheum,2006,54(8):2441-2451.

[22]Richette P,Dumontier MF,Fran?ois M,et al.Dual effects of 17beta-oestradiolon interleukin 1beta-induced proteoglycan degradation in chondrocytes.Ann Rheum Dis,2004,63 (2):191-199.

[23]Park YM,Kim SJ,Lee KJ,etal.Detection of CTX-IIin serum and urine to diagnose osteoarthritis by using a fluorom icrobeads guiding chip.Biosens Bioelectron,2015,67: 192-199.

[24]Rousseau JC,Garnero P.Biologicalmarkers in osteoarthritis.Bone,2012,51(2):265-277.

11α,,2525(OH)(OH)22D D33 regulatesdegradation of type f typeⅡcollagen in articular cartilage*

LISiwei,NIUGuodong,LIU Zhongjun,SONGChunli,ZHANG Ke**,LENGHuijie**
(Departmentof Orthopedics,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China)

ords:Vitamin D;Osteoarthritis;Chondrocytes;Cartilageexplants culture;C-telopeptide fragmentsof typeⅡcollagen

2095-9958（2015）04-0 161-06

10.3969/j.issn.2095-9958.2015.02-014

國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：11472017，1002004）

**通信作者：冷慧杰，Email：lenghj@bjmu.edu.cn；張克，Email：zhangke60@medmail.com.cn