黃欽海，周志衡，雷毅雄，劉 群

(廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510182)

鎘(Cadmium，Cd)是已被確認(rèn)的人類致癌物。鎘及其化合物是常見的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，長期暴露可引起腎臟、肝臟、前列腺、睪丸和肺臟等器官功能障礙，甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。鎘的致癌作用機(jī)制十分復(fù)雜，盡管人們做了大量的研究，但至今未能完全闡明其分子致癌機(jī)制。研究顯示，氯化鎘可導(dǎo)致DNA損傷和引起損傷修復(fù)障礙［1］。本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR(QPCR)法分析在亞慢性氯化鎘(CdCl2)染毒大鼠模型及其誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞系(16HBE)惡性轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞中hMSH2 mRNA表達(dá)的規(guī)律，探討鎘的致癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 染毒模型構(gòu)建

1.1.1 亞慢性氯化鎘染毒大鼠模型構(gòu)建(動物模型) 在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用SPF級別SD大鼠32只按體重隨機(jī)分4組，3個(gè)CdCl2染毒組(高劑量 1.225 mg·kg－1、中劑量 0.612 mg·kg－1和低劑量 0.306 mg·kg－1)和 1個(gè)生理鹽水對照組(0.9%NaCl)，每組8只大鼠，雌雄各半，腹腔注射，每天1次，每周5 d，連續(xù)14周。

1.1.2 氯化鎘誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型構(gòu)建(細(xì)胞模型) 本課題組早期建立的氯化鎘(CdCl2)誘發(fā)人支氣管上皮(16HBE)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型［2］:以MEM培養(yǎng)液［含10%(V/V)小牛血清］培養(yǎng)16HBE系細(xì)胞，于指數(shù)生長期加入終濃度15μmol·L－1的CdCl2，作用24 h，每隔12 d處理1次，共處理 10次，細(xì)胞培養(yǎng)至第35代，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，軟瓊脂集落分析及裸鼠成瘤試驗(yàn)，證實(shí)CdCl2具有惡性轉(zhuǎn)化16HBE的作用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 16HBE細(xì)胞、氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞系第4、14、35代細(xì)胞、成瘤細(xì)胞(鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE 35代細(xì)胞接種裸鼠成瘤，分別以同代的無鎘處理的16HBE細(xì)胞(無鎘處理第4、14、35代細(xì)胞)為對照細(xì)胞，用含小牛血清10%(V/V)的MEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 QRT-PCR技術(shù)檢測hMSH2的mRNA表達(dá)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成，其序列如下:大鼠hMSH2上游引物為 5'－ CAGCAGAGGTGTCCATTGTG －3'，下游引物為5'－GCAGTTTCCAGCA TTTCAGC －3'，大鼠內(nèi)參GAPDH上游引物為5'－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3'，下游引物為:5'－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3'。細(xì)胞模型hMSH2上游引物為 5'－CATCCAGGCATGCTTGTGTTGA －3'，下游引物為5'－GCAGTCCACAATGGACACTTC－3'，內(nèi)參β－Actin上游引物為5'－ACAGAG CCTCGCCTTTGCCGAT－3'，下游引物 5'－CTTGCACATGCCGGAGCCGTT －3'。

1.3.2 總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄 于－80℃ 冰箱取出亞慢性氯化鎘染毒大鼠模型肺臟、肝臟和腎臟組織，液氮下研磨，移至1.5 mL無RNA酶EP管中，按Trizol試劑盒(GIBCO BRC)說明書的步驟提取總RNA(用紫外分光核酸蛋白分析儀測RNA的純度和濃度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性)。取對數(shù)生長期各組氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞，每管加1 mL Trizol后按上面相同步驟提取和鑒定總RNA。按promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)說明書方法逆轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。cDNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檢測hMSH2的mRNA表達(dá) 按promega GoTaq?QPCR master mix(A6001)試劑盒(說明書操作步驟，在ABI 7900 Real Time PCR反應(yīng)儀器上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:95℃10 min預(yù)變性;95℃15 s，60℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)△Ct=樣品Ct均值－內(nèi)參照Ct均值計(jì)算所得2－△△Ct即代表被檢樣品hMSH2基因mRNA的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件處理系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。hMSH2 mRNA的相對含量以±s表示，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD或SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 亞慢性CdCl2染毒大鼠模型中hMSH2 mRNA表達(dá)水平 結(jié)果顯示，與對照組(未染毒組)相比，肺臟和腎臟組織hMSH2 mRNA表達(dá)水平均存在顯著降低，高劑量組降低明顯，且呈隨染毒劑量升高而降低趨勢(P＜0.05)。肝臟組織hMSH2 mRNA表達(dá)水平也呈降低趨勢，但未見顯著差異，見表1。

表1 亞慢性Cd Cl2染毒大鼠組織hMSH2 mRNA相對表達(dá)量(±s)

表1 亞慢性Cd Cl2染毒大鼠組織hMSH2 mRNA相對表達(dá)量(±s)

注:肺 F=5.572，腎 F=3.875，均 P ＜0.05;* 表示與對照組比較，P ＜0.05(LSD 檢驗(yàn))。

組別 動物/只 肺臟 肝臟 腎臟對照組8 1.06 ±0.39 1.04 ±0.36 1.11 ±0.52低劑量組 8 0.79 ±0.28* 0.95 ±0.46 0.97 ±0.14中劑量組 8 0.62 ±0.11* 0.85 ±0.30 0.81 ±0.27高劑量組 8 0.61 ±0.12* 0.66 ±0.13 0.60 ±0.20*

2.2 16HBE細(xì)胞Cd Cl2惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型中hMSH2 mRNA表達(dá)水平 結(jié)果表明，與對照組(未染毒組)16HBE細(xì)胞相比，惡性轉(zhuǎn)化組(染毒組)細(xì)胞hMSH2 mRNA表達(dá)水平顯著性降低，呈隨惡性轉(zhuǎn)化代數(shù)的增加而降低趨勢，第35代細(xì)胞和成瘤細(xì)胞顯著下降(P＜0.05)。見圖1。

3 討論

DNA 錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair gene，MMR)基因由一系列特異性修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的酶分子組成，具有修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配，防止基因突變，維持基因穩(wěn)定的功能。一旦MMR基因產(chǎn)生突變和遺傳多態(tài)性，導(dǎo)致其表達(dá)和功能改變，降低甚至失去正常的錯(cuò)配修復(fù)能力，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［3－6］。MMR包括 hMLH1、hMSH2、hPMS1、hPMS2、hMSH3、hMSH6等，近年來研究發(fā)現(xiàn)90%以上的突變發(fā)生于 hMLH1 和 hMSH2［7－9］，進(jìn)而破壞細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，引起細(xì)胞異常增殖及分化，形成腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)因素［10］。研究表明hMSH2基因可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮腫瘤抑制功能［11］。因此，hMSH2基因的正常表達(dá)對維持其MMR功能有著重要意義，是維持基因穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)。

鎘已被確定為人類I類致癌物，其分子致癌機(jī)制十分復(fù)雜，至今未能充分闡明。hMSH2基因在鎘致機(jī)體組織損傷及致癌過程中的作用甚少報(bào)道，其作用機(jī)制至今未被完全闡明。腫瘤組織往往存在相關(guān)基因的表達(dá)異常［12］，研究基因表達(dá)變化對尋找腫瘤標(biāo)志物和了解致癌機(jī)制具有重要意義。本研究利用CdCl2染毒模型，在大鼠和人16HBE細(xì)胞中分別研究hMSH2基因表達(dá)水平的變化。研究結(jié)果顯示，在亞慢性CdCl2染毒大鼠模型中，大鼠肺和腎臟組織hMSH2基因表達(dá)水平均呈隨染毒劑量的增加而下降趨勢，高劑量組下降尤為明顯(均P＜0.05);細(xì)胞CdCl2染毒惡性轉(zhuǎn)化模型中，隨著轉(zhuǎn)化代數(shù)的增加，hMSH2基因表達(dá)水平也呈現(xiàn)降低趨勢，到第35代和成瘤細(xì)胞顯著降低(P＜0.05)。說明CdCl2染毒模型中組織和細(xì)胞hMSH2 mRNA呈異常表達(dá)，提示hMSH2基因異常表達(dá)可能與鎘的致癌作用有關(guān)。其作用機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

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