劉坤媛，田秀麗，秦治國，潘思軼，徐曉云，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢 430070；2.恩施州天然植物硒研究所，湖北 恩施 445000）

壺瓶碎米薺中含硒蛋白結(jié)構(gòu)特性及其緩解運(yùn)動性疲勞的作用

劉坤媛1，田秀麗1，秦治國2，潘思軼1，徐曉云1，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢 430070；2.恩施州天然植物硒研究所，湖北 恩施 445000）

目的：以純化的壺瓶碎米薺含硒蛋白（selenium-containing protein from Cardamine hupingshanensis，S PCH）為研究對象，對其結(jié)構(gòu)特性和緩解運(yùn)動性疲勞作用進(jìn)行評價。方法：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylam ide gelelectrophoresis，PAGE）和十二烷基硫酸鈉-PAGE（sodium dodecyl sulfate-PAGE，SDS-PAGE）、氨基酸組成分析、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）分析，對SPCH的純度、亞基組成、氨基酸組成及含量進(jìn)行評價并初步預(yù)測SPCH的匹配蛋白。采用小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗，通過檢測游泳時間、血乳酸（blood lactic acid，BLA）、肝糖原和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平，評價SPCH對小鼠運(yùn)動性疲勞的影響。結(jié)果：SPCH可能由3個分子質(zhì)量分別為37、39、40 kD的亞基組成，與之相匹配的蛋白可能是DING protein、Predicted protein和Chalcone synthase。SPCH能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間（P＜0.01），同時增強(qiáng)清除乳酸的能力（P＜0.01），增加肝糖原含量（P＜0.01），還具有降低BUN水平的能力（P＜0.05）。結(jié)論：SPCH對小鼠具有較好的緩解運(yùn)動性疲勞作用，可考慮將其開發(fā)成為緩解運(yùn)動性疲勞的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。

壺瓶碎米薺；含硒蛋白；純化；結(jié)構(gòu)分析；緩解運(yùn)動性疲勞

壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis）是一種富硒能力極強(qiáng)的十字花科植物。硒在植物體內(nèi)的存在形態(tài)比較復(fù)雜，人們把通過密碼子UGA編碼蛋白質(zhì)，即硒以Se—Cys形式存在的蛋白稱為硒蛋白，若以其他方式（如Se—Met）存在的蛋白則稱為含硒蛋白[1-2]，由于植物蛋白中一般都會含有Se—Met和Se—Cys，因此本實(shí)驗將統(tǒng)一稱之為含硒蛋白。

含硒蛋白是富硒植物中大分子硒的主要存在形式[2-3]，含硒蛋白的分離分析對防治缺硒而引起的疾病有重要意義。自1973年Rotruck等[4]初次證實(shí)硒參與組成了谷胱甘肽過氧化物酶的活性組分以來，含硒蛋白逐漸被關(guān)注并成為研究熱點(diǎn)[5]。彭振坤等[6]對富硒地區(qū)的大豆進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)以蛋白形式存在的硒含量最高，約占總硒含量的63%。目前，植物含硒蛋白的分離純化大多同時采用幾種方 法，如采用分段鹽析與柱層析結(jié)合分離得到純化含硒蛋白[7]。

疲勞是一種涉及許多生理和生化因素的綜合性過程，是人體精神或體力活動達(dá)到一定程度時不可避免的一種正常生理反應(yīng)[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)自由基與運(yùn)動性疲勞有著密切的關(guān)系[9-13]。Davies等[14]證實(shí)運(yùn)動疲勞后肝臟及肌肉中的自由基數(shù)量顯著增加，由此說明自由基可由運(yùn)動產(chǎn)生。而含硒蛋白對脂質(zhì)過氧化物的清除效果較亞硒酸鈉和不含硒蛋白組極其明顯，同時該研究顯示含硒蛋白可降低γ輻射對人紅細(xì)胞的損傷，并且在清除羥自由基方面效果顯著[15]。雷紅靈[16]也發(fā)現(xiàn)恩施碎米薺中純化含硒蛋白具有較好的氧自由基清除能力及抗脂質(zhì)過氧化能力，同時還可以保護(hù)動物的線粒體、肝臟及紅細(xì)胞免受過氧化損傷。因此，推測壺瓶碎米薺純化含硒蛋白有可能通過清除機(jī)體由于運(yùn)動而產(chǎn)生的自由基而發(fā)揮緩解運(yùn)動性疲勞的活性，這一猜想尚需進(jìn)一步實(shí)驗進(jìn)行驗證。

本實(shí)驗以小鼠負(fù)重游泳為模型，以力竭游泳時間、血乳酸（blood lactic acid，BLA）含量、肝糖原儲備量、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量為生化測定指標(biāo)，研究壺瓶碎米薺純化含硒蛋白（seleniumcontaining protein from Cardamine hupingshanensis，SPCH）的緩解運(yùn)動性疲勞作用，為拓展含硒蛋白的用途提供實(shí)驗依據(jù)，促進(jìn)硒資源的開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動物

壺瓶碎米薺水提物（以下簡稱為水提物）由盛硒生物有限公司提供，為壺瓶碎米薺全植株水提物的噴霧干燥粉末，呈深褐色。其中，總蛋白質(zhì)含量為（30.53±0.66） mg/g，硒含量為（856.36±17.94） μg/g。

紅景天西洋參膠囊 廣州市賽健生物科技有限公司，主要原料為紅景天提取物、西洋參、精氨酸、微晶纖維素，每100 g含紅景天苷300 mg、總皂苷1.12 g、精氨酸12 g。

BLA測定試劑盒、肝糖原測定試劑盒、BUN試劑盒南京建成試劑有限公司；G-100葡聚糖凝膠柱、DEAE-FF陰離子交換柱 武漢鼎國昌盛生物科技有限公司；亞硒酸鈉 美國Amresco公司；其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

140 只4 周齡SPF級昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購自武漢生物制品研究所有限公司，批號為42000400001247，許可證號為SCXK（鄂）2008-0003。

1.2 儀器與設(shè)備

BT-2245電子天平 德國Sartorius公司；Multiskan Go酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司；5804R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；LGJ-185冷凍干燥機(jī)北京松源華興科技發(fā)展有限公司；HH-4恒溫水浴箱國華電器有限公司；BSZ-100自動收集器、HL-2S恒流泵上海滬西分析儀器有限 公司；AFS-8220原子熒光光度計吉天儀器有限公司；DYY-Ⅱ-28A垂直夾芯式電泳槽、DYY-Ⅲ4高壓雙穩(wěn)電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 壺瓶碎米薺純化含硒蛋白樣品的制備

水提物按料液比1∶20（m/V）加入蒸餾水使其充分溶解，添加(NH4)2SO4至飽和度55%，4 ℃放置12 h，6 000 r/min離心10 min，收集沉淀，真空冷凍干燥48 h，得到粗蛋白粉末。

粗蛋白經(jīng)柱層析（Sephadex G-100凝膠柱層析和DEAE-FF陰離子交換柱層析）分級純化得壺瓶碎米薺純化含硒蛋白（SPCH）。

Sephadex G-100柱層析條件為：26 mm×500 mm層析柱，以緩沖液洗脫，上樣質(zhì)量濃度200 mg/mL，上樣體積2 mL，調(diào)節(jié)恒流泵轉(zhuǎn)速至5 r/min，洗脫的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0 mL。280 nm波長處紫外跟蹤檢測，洗到蛋白洗脫曲線幾乎與基線一致時停止收集。將同一組分收集合并，透析72 h后濃縮冷凍干燥，得到組分1（F1）和組分2（F2），采用凱氏定氮法和氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定不同級分的蛋白質(zhì)含量和硒含量。

F1蛋白含量、硒含量較高，作為進(jìn)一步純化樣品上纖維素DEAE-FF柱，以0～1 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，上樣質(zhì)量濃度10 mg/mL，上樣體積2 mL，調(diào)節(jié)恒流泵轉(zhuǎn)速至3.8 r/min，每管收集1.5 mL，得到分子質(zhì)量分布更加集中的含硒蛋白。以收集時間為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到洗脫曲線。將同一組分收集合并，得到4 種蛋白分離組分F11、F12、F13、F14，透析72 h后濃縮冷凍干燥，得到純化含硒蛋白粉末，采用凱氏定氮法和氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法分別測定不同級分的蛋白質(zhì)含量和硒含量。本實(shí)驗中選用蛋白質(zhì)含量及硒含量均比較高的純化含硒蛋白F14為研究對象。

1.3.2 壺瓶碎米薺純化含硒蛋白的結(jié)構(gòu)定性

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）和十二烷基硫酸鈉-PAGE（sodium dodecyl sulfate-PAGE，SDS-PAGE）檢測分析純化含硒蛋白F14（SPCH）的純度及亞基組成。利用SDS不連續(xù)體系垂直板電泳檢測，采用10%分離膠和5%濃縮膠。按照常規(guī)電泳操作步驟進(jìn)行，取純化含硒蛋白F14溶液0.5 mL溶于0.1 mL樣品緩沖液，混勻后進(jìn)樣，每孔15 ?L。電泳初始時，濃縮膠電流為15 mA，進(jìn)入分離膠后電流加大到80 mA，待指示液距離下端1～2 cm時關(guān)閉電源。將膠小心取出，室溫條件下染色（染色液為考馬斯亮藍(lán)R-250）1 h，然后用脫色液脫色，每半小時換1 次脫色液，至少換3 次脫色液至凝膠背景透明即可。在SDS-PAGE中，樣品緩沖液中添加β-巰基乙醇和SDS，且上樣液于沸水浴中煮沸3～5 min后迅速冷卻，其余操作與PAGE相同。

SPCH經(jīng)鹽酸水解后，使用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成及含量[17]。

氨基酸的水解：準(zhǔn)確稱取一定量的純化含硒蛋白，置于離心管中，用l mL 6 mol/L HCl溶解，充完氮?dú)怦R上蓋上蓋子，在110 ℃條件下酸解1 d，冷卻至室溫，干燥酸解后樣品，以少量水溶解樣品，再干燥1 次，如此反復(fù)3 次，最后以1mL 0.1 mol/L HCl溶解，過0.45 ?m孔徑微孔濾膜，備用。

使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）分析純化含硒蛋白的匹配蛋白[14]。MALDI-TOF-MS相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：檢索類型：二級質(zhì)譜；酶：胰蛋白酶；可修飾方式：氧化反應(yīng)；質(zhì)量值：單一同位素；蛋白質(zhì)質(zhì)量：不限；肽段質(zhì)量公差：±100 ppm；碎片離子質(zhì)量公差：±0.8 D；酶切位點(diǎn)數(shù)：1；查詢次數(shù)：32。

1.3.3 壺瓶碎米薺緩解運(yùn)動性疲勞活性研究

1.3.3.1 實(shí)驗動物分組及給藥劑量

小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成7 組，每組20 只，雌雄各半，設(shè)純化含硒蛋白SPCH（F14）低、中、 高3 個劑量組（含硒量分別為8.3、16.6、83.3 ?g/（kg?d）），另設(shè)空白對照組（生理鹽水）、陽性對照組（紅景天西洋參膠囊240 mg/（kg?d），為產(chǎn)品說明書推薦用量經(jīng)折算后的小鼠用量）、水提物組（含硒量16.6 ?g/（kg?d））及亞硒酸鈉組（含硒量6.84 ?g/（kg?d），為小鼠谷胱甘肽過氧化物酶活性達(dá)到飽和所需補(bǔ)充的硒元素含量的2/3）。經(jīng)口灌胃，連續(xù)灌胃30 d，小鼠灌胃量10 mL/kg。所有小鼠實(shí)驗期間給予鼠維持飼料，自由攝食。

1.3.3.2 力竭游泳實(shí)驗

灌胃給予受試物30 min后，將小鼠尾部負(fù)重5%體質(zhì)量的鉛皮，將各組小鼠放入游泳箱中，水深＞30 cm，水溫（25±0.5） ℃，進(jìn)行力竭游泳實(shí)驗。期間觀察小鼠游泳情況，并不時用玻璃棒揮動小鼠使其始終保持游泳狀態(tài)。計小鼠入水后開始游泳到瀕死狀態(tài)的時間（小鼠頭不浮出水面8 s為指標(biāo)）為小鼠力竭游泳時間[18]。

1.3.3.3 BLA含量測定

末次灌胃給予受試物30 min后，將小鼠尾部負(fù)重2%體質(zhì)量的鉛皮，于（30±0.5） ℃水中游泳60 min后停止，休息15 min后，摘眼球采血，使用抗凝管收集血液，用于BLA含量的測定，BLA具體測定方法詳見試劑盒說明書。

1.3.3.4 BUN和肝糖原含量測定

末次灌胃給予受試物30 min后，小鼠在溫度為（30±0.5） ℃的水中游泳90 min，休息60 min后摘眼球采血（不加抗凝劑），37 ℃放置0.5 h，然后4 ℃放置3 h，血液凝固后，3 000 r/min離心15 min，分離血清用于BUN含量測定。

取血完畢后立即將小鼠處死，摘取肝臟，以生理鹽水洗凈表面血水，濾紙吸去多余水分，稱取75 mg肝臟組織用于肝糖原含量的測定。

肝糖原、BUN含量的具體測定方法詳見試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 壺瓶碎米薺含硒蛋白的鑒定及結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 PAGE和SDS-PAGE結(jié)果

對純化含硒蛋白組分進(jìn)行PAGE和SDS-PAGE，結(jié)果見圖1。

圖1 純化含硒蛋白的變性（a）和非變性（b）電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE (a) and PAGE (b) profiles of purified seleniumcontaining protein

由圖1可知，PAGE圖中只有一個條帶，表明純化含硒蛋白具有較高的相對純度；SDS-PAGE圖中顯示有3 個條帶，這是由于變性電泳中β-巰基乙醇將蛋白結(jié)構(gòu)中的二硫鍵打開，形成了多個亞基，推測該蛋白由3 種分子質(zhì)量不同的亞基構(gòu)成。經(jīng)計算3 種亞基的分子質(zhì)量約為37、39、40 kD。

2.1.2 氨基酸組成分析

表1 純化含硒蛋白的氨基酸組成分析Table 1 Amino acid compositions of selenium-containing protein

由表1可知，SPCH中半胱氨酸、蛋氨酸含量極低，幾乎為0。推測可能是由于硒以Se—Met和Se—Cys的形式存在于蛋白質(zhì)中形成植物含硒蛋白因而未被檢測出來，與雷紅靈[16]關(guān)于含硒蛋白的研究結(jié)論一致。

2.1.3 MALDI-TOF-MS圖譜分析

圖2 Mascot檢索結(jié)果Fig.2 Mascot search results

純化含硒蛋白經(jīng)PAGE檢測為單一蛋白條帶，說明樣品蛋白已達(dá)電泳純，但與候選蛋白肽段覆蓋率并不是很高（圖2），可能是由于硒與硫的代謝路徑具有相似性，硒在進(jìn)入蛋白前要先經(jīng)過有機(jī)化，即以Se—Met和Se—Cys的形式[19-20]代替Met和Cys，參與含硒蛋白的合成。

表2 MALDI-TOF-MS分析結(jié)果Table 2 Proteins analyzed by MALDI-TOF-MS

附錄檢索數(shù)據(jù)（表2）進(jìn)一步驗證了上述推斷：純化含硒蛋白與候選蛋白（gi|295687390）肽段相同序列中均不含Met和Cys殘基，與候選蛋白（gi|168066734、gi|90017730）肽段相同序列中共有5 個Met殘基，其中2 個均被氧化，間接表明蛋白中原有Met和Cys中的硫被硒所代替，形成對應(yīng)的含硒氨基酸，從而進(jìn)入到蛋白質(zhì)中形成含硒蛋白。

經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定分析，與純化含硒蛋白相匹配的蛋白可能是DING protein、Predicted protein和Chalcone synthase。

2.2 壺瓶碎米薺提取物的緩解運(yùn)動性疲勞活性研究

2.2.1 力竭游泳實(shí)驗結(jié)果

實(shí)驗過程中，小鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，實(shí)驗結(jié)束時，小鼠體質(zhì)量較實(shí)驗初始時顯著增加；雌鼠的體質(zhì)量增加量小于雄鼠，差異顯著；實(shí)驗組間，空白對照組、各實(shí)驗組雌鼠體質(zhì)量增加量無顯著差異；空白對照組、各實(shí)驗組雄鼠體質(zhì)量增加量無顯著差異。

表3 純化含硒蛋白對小鼠負(fù)重游泳時間的影響Table 3 Effect of selenium-containing protein on loaded-swimming time in mice ice

疲勞的最主要表現(xiàn)是運(yùn)動耐力的下降，運(yùn)動耐力是反映機(jī)體疲勞最直接、最客觀的指標(biāo)[21]。由表3可知，SPCH可延長小鼠負(fù)重游泳時間，除亞硒酸鈉組外，各實(shí)驗組與空白對照組比較，均表現(xiàn)出明顯差異（P＜0.01）；與陽性對照組相比，SPCH中、高劑量組差異均極顯著（P＜0.01）；同時SPCH在延長小鼠運(yùn)動耐力方面較水提物組具有明顯優(yōu)勢，且SPCH中劑量組即具有較好的效果。與其他相關(guān)文獻(xiàn)[22-23]的數(shù)據(jù)相比，各組的負(fù)重游泳時間均低于文獻(xiàn)中對應(yīng)值，這可能與有些文獻(xiàn)中小鼠尾部負(fù)重質(zhì)量不同，或游泳環(huán)境不同有關(guān)。

2.2.2 BLA含量測定結(jié)果

若機(jī)體進(jìn)行連續(xù)劇烈運(yùn)動時間超過10 s，則肌肉將不能獲得足夠氧氣，這時大部分能量需要通過糖原的無氧酵解來產(chǎn)生，從而生成許多乳酸，乳酸積累太多會打破內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，機(jī)體不能進(jìn)行正常生理代謝，最終導(dǎo)致疲勞[10]。機(jī)體乳酸的堆積由乳酸的生成速率和清除速率共同決定，因此減少乳酸的生成或加速乳酸的清除都可起到緩解運(yùn)動性疲勞的效果，乳酸含量可作為衡量機(jī)體有氧代謝能力、減緩疲勞產(chǎn)生和加速疲勞消除的指標(biāo)[24]。

表4 純化含硒蛋白對小鼠運(yùn)動后BLA含量的影響Table 4 Effect of selenium-containing protein on blood lactic acid in mice after exercise

由表4可知，與空白對照組相比，雌鼠的SPCH中、高劑量組的BLA含量下降（P＜0.01或P＜0.05）；雄鼠的SPCH低、中、高劑量組BLA含量極顯著降低（P＜0.01）；與陽性對照組比較，雌鼠、雄鼠的SPCH各劑量組在加速乳酸消除方面均無顯著差異；雄鼠的水提物組與空白對照組相比，BLA含量差異不顯著，SPCH較水提物顯示出更強(qiáng)的減少代謝產(chǎn)物（乳酸）堆積的能力，延緩疲勞的產(chǎn)生。

2.2.3 肝糖原含量測定結(jié)果

機(jī)體之所以產(chǎn)生疲勞的原因之一是由于體內(nèi)消耗了過多的能量，糖原可以為機(jī)體提供大量能量，因此可以把機(jī)體內(nèi)糖原含量的多少作為衡量疲勞產(chǎn)生快慢或疲勞程度的指標(biāo)[7]。

由表5可知，與空白對照組相比，SPCH中、高劑量組的肝糖原含量升高，顯著極差異（P＜0.01）；而水提物和亞硒酸鈉對小鼠肝糖原含量無顯著影響。以上結(jié)果表明SPCH水提物能夠更好地為機(jī)體維持運(yùn)動時的血糖水平，從而更好地達(dá)到緩解運(yùn)動性疲勞的目的。

表5 純化含硒蛋白對小鼠運(yùn)動后肝糖原含量的影響Table 5 Effect of selenium-containing protein on hepatic glycogen in mice after exercise

2.2.4 BUN含量測定結(jié)果

表6 純化含硒蛋白對小鼠運(yùn)動后BUN含量的影響Table 6 Effect of selenium-containing protein on BUN in mice after exercise

由表6可知，在降低BUN含量方面，水提物組效果更好，與空白對照組、陽性對照組比較，均具有顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。水提物能更有效地減輕運(yùn)動時機(jī)體利用蛋白質(zhì)供能的狀況，這可能是由于水提物中其他含硒物質(zhì)或者其他成分與含硒蛋白產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的結(jié)果。

3 討 論

含硒蛋白的分離純化是一個非常復(fù)雜而繁瑣的過程，通過硫酸銨沉淀、柱層析（葡聚糖凝膠柱層析、陰離子交換柱層析）分級純化得到含硒蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測，該蛋白組分呈現(xiàn)單一條帶，樣品達(dá)到電泳純，為后續(xù)研究碎米薺含硒蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性奠定了基礎(chǔ)，經(jīng)計算純化含硒蛋白3 個亞基的分子質(zhì)量大約為37、39、40 kD。

對純化含硒蛋白進(jìn)行氨基酸組成分析，半胱氨酸、蛋氨酸含量極低，幾乎為0，推測可能是由于硒以Se—Met和Se—Cys的形式進(jìn)入蛋白質(zhì)中，形成含硒蛋白，從而未被檢測出。含硒蛋白經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定分析，與純化含硒蛋白相匹配的蛋白可能是DING protein、Predicted protein和Chalcone synthase。

硒的成人推薦攝入量每天最少50 ?g，人體體質(zhì)量以60 kg計，即每天硒需要量為0.83 ?g/kg，按照小鼠與人的換算系數(shù)10，則小鼠硒的最低需要量為8.3 ?g/（kg?d），將該劑量作為低劑量組，分別提高2、10 倍作為中、高劑量組；陽性對照組使用劑量也是根據(jù)該藥的成人推薦使用量再乘以小鼠與人的換算系數(shù)計算而得。

無機(jī)硒生物利用率低，易在肝臟、心臟、脾臟、腎臟等組織中積累，過量會引起中毒[25]，日本在1993年已禁止向食品中添加無機(jī)硒。田俊梅[26]以缺硒Sprague-Dawley（SD）大鼠為動物模型，研究硒強(qiáng)化劑的生物利用效果，采用的分組劑量為2、4、8、16 μg/（kg?d），結(jié)果顯示亞硒酸鈉組即使在硒含量僅為2 μg/（kg?d）時，較硒蛋白在肝腎組織存在更高程度的硒積累，易引起過量中毒。姚昭等[27]研究硒的抗氧化作用時，以SD大鼠為動物模型，采用的硒元素用量為人體血液中谷胱甘肽過氧化物酶活性達(dá)到飽和所需補(bǔ)充的硒元素含量折算后的大鼠用量，在該濃度下無機(jī)硒能影響大鼠抗氧化能力。2001年，Combs[28]研究發(fā)現(xiàn)硒的攝入量只需達(dá)到谷胱甘肽過氧化物酶活性飽和值的2/3左右即可使谷胱甘肽過氧化物酶活性充分表達(dá)。本實(shí)驗以昆明小鼠負(fù)重力竭游泳實(shí)驗為模型，著重研究補(bǔ)充SPCH對緩解運(yùn)動性疲勞的作用，參考的亞硒酸鈉組在實(shí)驗設(shè)計時兼顧亞硒酸鈉安全性與功能活性，硒含量取小鼠谷胱甘肽過氧化物酶活性達(dá)到飽和所需補(bǔ)充硒元素含量的2/3，即6.84 μg/（kg·d）。

由實(shí)驗結(jié)果可知，SPCH各劑量組中，低劑量組含硒蛋白的活性作用并不明顯，而中、高劑量組效果顯著，通過對純化蛋白補(bǔ)硒劑量的研究，可知中劑量（16.6 ?g/（kg?d））SPCH即可達(dá)到較好的緩解運(yùn)動性疲勞效果；比較各項測定指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)SPCH活性作用明顯優(yōu)于亞硒酸鈉組，在實(shí)驗條件下有機(jī)硒（含硒蛋白組）與無機(jī)硒（亞硒酸鈉組）相比，具有更好地緩解運(yùn)動性疲勞作用，但是由于硒元素含量的不同，實(shí)驗結(jié)果并不具備直接的可比性；SPCH能通過顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間、提高運(yùn)動后肝糖原含量、降低血尿素氮水平、減緩乳酸產(chǎn)生或增強(qiáng)乳酸清除能力，從而發(fā)揮出較壺瓶碎米薺水提物更有效的緩解運(yùn)動性疲勞作用。實(shí)驗結(jié)果表明將水提物中含硒蛋白進(jìn)行分離純化有助于提升其活性作用。

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Structure Characteristics and Anti-motor Fatigue Activity of Selenium-Containing Protein from Cardamine hupin gshanensis

LIU Kunyuan1， TIAN Xiuli1， QIN Zhiguo2， PAN Siyi1， XU Xiaoyun1，*
(1. Key Laboratory of Environment Correlative Dietology， Ministry of Education， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070， China; 2. Enshi Research Institution of Natural Plant Selenium， Enshi 445000， China)

This study evaluated the structure characteristics and anti-motor fatigue activity of selenium-containing protein purified from Cardamine hupingshanensis (SPCH). The purity， subunit composition， amino acid composition and matching protein of SPCH were analyzed by using PAGE， SDS-PAGE， amino acid analyzer and matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The anti-motor fatigue activity of SPCH was investigated by measuring swimming time， blood lactic acid， hepatic glycogen and serum urea nitrogen in mice in weight-loaded swimming test. Results showed that SPCH had three subunits with molecular weights of 37， 39 and 40 kD respectively. The matching protein might be DING protein， predicted protein or chalcone synthase. The results also showed that SPCH significantly prolonged the swimming time of mice (P ＜ 0.01)， decreased blood lactic acid content (P ＜ 0.01)， increased hepatic glycogen content (P ＜ 0.01)， and reduced serum urea nitrogen content (P ＜ 0.05). In conclusion， SPCH has a good anti-motor fatigue activity as a dietary supplement.

Cardamine hupingshanensis; selenium-containing protein; purification; structure analysis; anti-motor fatigue activity

TS201.4

A

1002-6630（2015）09-0160-06

10.7506/spkx1002-6630-201509029

2014-06-24

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B00；2012BAD31B08）

劉坤媛（1991—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。E-mail：15927361532@163.com

*通信作者：徐曉云（1970—），女，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)。E-mail：xuxiaoyun@mail.hzau.edu.cn