王文秀，于 佳，李 釤，魏玉西 *，宋惠平，許麗娜

（青島大學生命科學學院，山東 青島 266071）

不同條件對納豆菌發(fā)酵蛤蜊產(chǎn)物中游離氨基酸態(tài)氮含量及納豆激酶活性的影響

王文秀，于 佳，李 釤，魏玉西 *，宋惠平，許麗娜

（青島大學生命科學學院，山東 青島 266071）

利用納豆菌發(fā)酵蛤蜊，研究發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸態(tài)氮的含量及納豆激酶活性，并以二者為評價指標，探索其最佳發(fā)酵條件。經(jīng)單因素和正交設(shè)計試驗結(jié)果表明：發(fā)酵溫度為43 ℃、接種量為0.6%、發(fā)酵時間為48 h、料水比為1∶2（m/V）時發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸態(tài)氮含量最高（轉(zhuǎn)化率可達71.10%）；發(fā)酵溫度為41 ℃、接種量為 0.8%、發(fā)酵時間為48 h、料水比為1∶3（m/V）時發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活性最高。

蛤蜊；納豆菌；發(fā)酵；游離氨基酸態(tài)氮；納豆激酶活性

目前，采用傳統(tǒng)發(fā)酵法加工的水產(chǎn)品品種不多，產(chǎn)品的附加值不高。例如，傳統(tǒng)的自然發(fā)酵法生產(chǎn)蝦醬的工藝，由于發(fā)酵周期長、條件不易控制、產(chǎn)品鹽度高等缺點，使其生產(chǎn)量、食用范圍均受到一定限制。

納豆菌屬細菌科、芽孢桿菌屬，是納豆的生產(chǎn)菌種，同時又是人體有益菌群[1]。納豆菌能分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等大分子物質(zhì)，因而納豆類發(fā)酵產(chǎn)品中富含氨基酸、有機酸、寡聚糖等多種易被人體吸收的營養(yǎng)成分。同時，納豆制品中納豆激酶等活性物質(zhì)尚具有諸如溶血栓、抗腫瘤、降血壓等多種保健功能，還可預(yù)防骨質(zhì)疏松、提高蛋白質(zhì)的消化率，促進小腸黏膜細胞的增殖，保證腸功能等[2-6]。

近年來，隨著人們對納豆菌保健功能認識的深入，我國已有學者將納豆菌用于發(fā)酵蝦頭蝦殼[7]、紫菜[8]，與乳酸菌共同發(fā)酵制酸奶以及以果渣為底物發(fā)酵剩余豆渣等研究報道[9-10]。蛤蜊是沿海地區(qū)常見的營養(yǎng)豐富且價格相對低廉的貝類海產(chǎn)品，本實驗擬以蛤蜊為納豆菌發(fā)酵原料，探討使發(fā)酵物中游離氨基酸及納豆激酶含量最高的工藝方法，以期為蛤蜊等貝類的高值化利用提供新思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

納豆菌（活菌數(shù)為1.0×109CFU/g） 中山市納豆微生物制品有限公司；蛤蜊 青島大潤發(fā)超市。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器公司；Sartorius PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；721可見分光光度計 上海精密儀器有限公司；HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實業(yè)有限公司；GL-20G高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇凈集團·蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

選取長度約為4 cm鮮活蛤蜊，經(jīng)清水吐沙后于蒸鍋中微蒸，待外殼張開后取肉、勻漿。

1.3.2 游離氨基酸態(tài)氮（free ammonia nitrogen，F(xiàn)AN）含量的測定

參照文獻[11]進行，準確稱取混合均勻的樣品1.0 g，加入5 mL蒸餾水，充分攪拌，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。用干濾紙過濾，棄去濾渣。吸取20.0 mL上述樣品稀釋液于200 mL燒杯中，加水60 mL，開動恒溫磁力攪拌器，用0.05 mol/L NaOH標準溶液滴至酸度計指示為pH 8.2。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。再用0.05 mol/L NaOH標準溶液繼續(xù)滴定至pH 9.2，記錄標準溶液消耗的體積（V1，mL）。取80 mL水，在同樣的條件下做試劑的空白實驗，記錄標準溶液消耗的體積（V0，mL）。游離氨基酸態(tài)氮含量（X）計算見公式（1）。

式中：c為氫氧化鈉標準溶液濃度/（mol/L）；m為測定樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 納豆激酶（natto kinase，NK）活性的測定

采用Folin-酚法[12]，精確稱取1.0 g干酪素，用適量氫氧化鈉溶解，并加入pH 7.8的磷酸鹽緩沖液配制1%酪蛋白溶液。取1.0 g發(fā)酵物，用5 mL生理鹽水浸提12 h后得NK粗提液[13]。取2 mL酪蛋白溶液加入2 mL NK粗酶液，于40 ℃水浴酶解為1 h，加入2 mL 10%的三氯乙酸使NK酶失活，終止酶解反應(yīng)。取反應(yīng)液于5 000 r/min離心10 min，取上清液按Folin-酚法測定其OD680nm值，計算酶活力。酶活力單位定義為在40 ℃，pH 7.2的條件下，1 g固體發(fā)酵物水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位（IU）。

1.3.4 發(fā)酵原料中總氮含量測定

總氮含量按照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定[14]。

1.3.5 納豆菌發(fā)酵蛤蜊肉的單因素試驗

各因素試驗及后續(xù)正交試驗均作3 組平行，結(jié)果取平均值。發(fā)酵完畢后熟24 h，分別用甲醛滴定法、Folin-酚方法測定發(fā)酵液中游離氨基酸態(tài)氮含量和納豆激酶活性，以此評價發(fā)酵效果并確定單因素數(shù)值范圍。

1.3.5.1 發(fā)酵時間的選擇

取蛤蜊肉5 g，水5 mL，121 ℃滅菌20 min，接入質(zhì)量分數(shù)為0.2%的納豆菌固體粉末，放入43 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別發(fā)酵16、24、32、40、48、56、64 h。

1.3.5.2 發(fā)酵溫度的選擇

取蛤蜊肉5 g，水5 mL，121 ℃滅菌20 min，接入質(zhì)量分數(shù)為0.2%的納豆菌固體粉末，分別放入37、39、41、43、45、47 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。

1.3.5.3 接種量的選擇

取蛤蜊肉5 g，水5 mL，121 ℃滅菌20 min，分別接入質(zhì)量分數(shù)為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的納豆菌固體粉末，放入43 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。

1.3.5.4 料水比（m/V）的選擇

取蛤蜊肉5 g，分別加水2.5、5、7.5、10、12.5、15 mL，121 ℃滅菌20 min，接入質(zhì)量分數(shù)為0.2%的納豆菌固體粉末，放入43 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。以游離氨基酸態(tài)氮總量為考察指標，即發(fā)酵后產(chǎn)物的總量乘以游離氨基酸態(tài)氮含量得來的，由于值比較低，故將其換算成g/100 g來表示。

1.3.6 正交試驗方案設(shè)計

取蛤蜊肉5 g，根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，按照L16（45）方案設(shè)計正交試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間的選擇

圖1 發(fā)酵時間對游離氨基酸態(tài)氮含量及納豆激酶活性的影響Fig.1 Effect of fermentation time on free amino nitrogen concentration and nattokinase activity

由圖1可知，在48 h發(fā)酵時間內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，游離氨基酸態(tài)氮含量呈上升趨勢，48 h達到最高值0.511%，之后緩慢下降。這是因為發(fā)酵時間過短，則蛤蜊發(fā)酵不完全，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類不足以分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸；而發(fā)酵時間過長，在發(fā)酵成熟過程中產(chǎn)生的脫羧酶將游離氨基酸降解為生物胺（如亞精胺、精胺、腐胺和酪胺等）[15]，不僅降低了游離氨基酸態(tài)氮的含量，產(chǎn)生的生物胺對人體也極有害。在72 h發(fā)酵時間內(nèi)，納豆激酶活力的變化趨勢同游離氨基酸態(tài)氮含量基本一致，都是在發(fā)酵時間達48 h 時最高，為42.86 IU。

2.1.2 發(fā)酵溫度的選擇

圖2 發(fā)酵溫度對游離氨基酸態(tài)氮含量及納豆激酶活性的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on free amino nitrogen concentration and nattokinase activity

由圖2可知，發(fā)酵溫度為43 ℃時最有利于納豆菌發(fā)酵蛤蜊產(chǎn)生游離氨基酸態(tài)氮。這是因為，溫度過低納豆菌代謝緩慢，對蛤蜊的分解利用率低，致使游離氨基酸態(tài)氮含量低；若溫度過高也不利于菌體生長[16]。因此，就指標FAN而言，最佳發(fā)酵溫度為43 ℃，游離氨基酸態(tài)氮含量可達0.791%；就納豆激酶活性而言，發(fā)酵溫度為41 ℃時發(fā)酵產(chǎn)物的納豆激酶活力最高，為25.8 IU。

2.1.3 納豆菌接種量的選擇

接種量的大小是由生產(chǎn)菌種生長繁殖的速度決定的。一般說來，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵時間，使發(fā)酵產(chǎn)物的形成時間提前，同時也可減少雜菌的生長機會。但納豆菌是需氧菌[17]，接種量過大對發(fā)酵會產(chǎn)生不良影響，引起溶氧不足進而影響產(chǎn)物合成[18]。此外，接種量過大，菌體繁殖過快，菌體生長所需的養(yǎng)分不足，游離出來的氨基酸會被菌體重新利用，進而使游離氨基酸態(tài)氮的含量降低[19-20]，另外，接種量過大還會增加原料成本。納豆菌接種量對蛤蜊發(fā)酵效果的影響見圖3，接種量的大小將直接影響納豆菌對蛤蜊的發(fā)酵利用。當接種量為0.8%時，發(fā)酵產(chǎn)生的游離氨基酸態(tài)氮含量、納豆激酶活性均達最高（分別為0.651%和53.814 IU），此后開始降低。

圖3 納豆菌接種量對游離氨基酸態(tài)氮含量及納豆激酶活性的影響Fig.3 Effect of inoculum quantity on free amino nitrogen concentration and nattokinase activity

2.1.4 料水比的選擇

圖4 料水比對游離氨基酸態(tài)氮總量及納豆激酶活性的影響Fig.4 Effect of solid-to-water ratio on free amino nitrogenconcentration and nattokinase activity

由圖4可知，在原料用量一定的情況下，隨著水用量的增加，發(fā)酵物中游離氨基酸態(tài)氮的總量、納豆激酶活性均顯著增加，當料水比達到1∶2以后，游離氨基酸態(tài)氮的總量增加趨于平緩；當料水比達到1∶2.5時，產(chǎn)物的納豆激酶活性最高，總酶活力為838.78 IU。

2.2 正交試驗結(jié)果

2.2.1 以游離氨基酸態(tài)氮總量為評價指標

表1 以游離氨基酸態(tài)氮總量為評價指標的正交試驗方案及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental values of free amino nitrogen concentration

正交試驗方案與結(jié)果見表1。根據(jù)極差R分析可知，影響其大小的因素順序依次為A＞B＞D＞C，因此溫度對發(fā)酵產(chǎn)生游離氨基酸態(tài)氮的影響最大，其次依次為發(fā)酵時間、料水比和接種量；根據(jù)均值結(jié)果k1、k2、k3、k4分析可知，最優(yōu)組合為：A3B3C2D3，因此納豆菌發(fā)酵蛤蜊產(chǎn)生游離氨基酸態(tài)氮的最適宜條件為：發(fā)酵溫度43 ℃、發(fā)酵時間48 h、接種量0.6%、料水比1∶2（m/V）。經(jīng)凱氏定氮法測得樣品總氮含量為9.76 g/100 g，則游離氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為71.10%。

2.2.2 以納豆激酶活力為評價指標

正交試驗方案與結(jié)果見表2。根據(jù)極差結(jié)果R分析可知，D＞B＞A＞C，因此料水比對發(fā)酵產(chǎn)物中納豆激酶活力的影響最大，其次依次為發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量；根據(jù)均值結(jié)果k1、k2、k3、k4分析可知，最優(yōu)組合為：A2B3C3D4，因此納豆菌發(fā)酵蛤蜊產(chǎn)高活力納豆激酶的最適宜條件為：發(fā)酵溫度41 ℃、發(fā)酵時間48 h、接種量0.8%、料水比1∶3。

表2 以納豆激酶活力為評價指標的正交試驗方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental values of nattokinase activity

3 結(jié) 論

以納豆菌發(fā)酵蛤蜊單因素試驗和正交設(shè)計結(jié)果表明：發(fā)酵溫度為43 ℃、接種量為 0.6%、發(fā)酵時間為48 h、料 水比為1∶2時發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸態(tài)氮總量最高（轉(zhuǎn)化率可達71.10%）；發(fā)酵溫度為41 ℃、接種量為0.8%、發(fā)酵時間為48 h、料水比為1∶3時發(fā)酵產(chǎn)物的納豆激酶活性最高。本實驗研究結(jié)果為以蛤蜊為原料通過納豆菌發(fā)酵生產(chǎn)出富含游離氨基酸和納豆激酶的調(diào)味品、保健食品，從而實現(xiàn)蛤蜊資源的高值化利用奠定了基礎(chǔ)。

[1] 布坎南R E， 吉布斯N E. 伯杰細菌學鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社， 1984: 735.

[2] SUMI H， HAMADA H， TSUSHIMA H， et al. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia， 1987，43(10): 1110-1111.

[3] ESAKI H， ONOZAKI H， OSAWA T. Antioxidative activity of fermented soybean products[M]//HUANG M T. Food phytochemicals for cancer preventionⅠ， fruits and vegetables. Washington D C: American Chemical Society， 1994: 353-360.

[4] 鐘青萍， 王斌， 石木標. 多功能保健食品: 納豆[C]//2002年廣州市微生物學會年會論文集. 廣州: 2002: 12-16.

[5] SUMI H. Antibacterial activity of Bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli-O157[J]. Bioindustry， 1997， 14: 47-49.

[6] SUMI H. Accumulation of vitamin K (menaquione-7) in plasma after indigestion of natto and natto bacilli (B. subtillis natto)[J]. Food Science and Technology Research， 1999， 5: 48-50.

[7] 付剛， 武利剛， 段杉， 等. 納豆菌發(fā)酵蝦頭、蝦殼過程所產(chǎn)蛋白酶的活力影響因素研究[J]. 中國調(diào)味品， 2013， 38(11): 9-13.

[8] 羅克軒. 以體外分析模式探討紫菜納豆菌發(fā)酵產(chǎn)品之抗氧化及抗發(fā)炎活性[D]. 基隆: 臺灣海洋大學， 2012: 22-53.

[9] 黎婉園， 陳中， 夏楓耿， 等. 利用納豆菌種發(fā)酵奶液的研究[J]. 中國食品添加劑， 2011(1): 82-85.

[10] ZHANG Hong， LUO Yongquan， HUANG Zhibing， et al. Optimization of solid state fermentation conditions using a mixture of bean curd residue and marc with Bacillus natto[J]. Agricultural Science & Technology， 2011， 12(4): 474-476; 519.

[11] 王永華， 張水華. 食品分析[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社， 2002: 139-140.

[12] 胡靜. 納豆激酶的活性測定[J]. 海峽藥學， 2013， 25(5): 47-48.

[13] 鮑艷霞， 陳鈞， 王萍， 等. 影響納豆激酶酶促反應(yīng)速度因素的研究[J].氨基酸和生物資源， 2004， 26(3): 70-72.

[14] 中華人民共和國衛(wèi)生部中國國家標準化管理委員會. GB/T 5009.5—2003 食品中蛋白質(zhì)的測定[S]. 北京: 中國標準出版社，2004.

[15] 王永麗， 李鋒， 陳肖， 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中生物胺形成機理及檢測控制技術(shù)[J]. 肉類研究， 2013， 27(6): 39-43.

[16] 黃占旺， 魏萍， 劉海林， 等. 納豆菌生物學特性研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報， 2004， 26(1): 83-85.

[17] 滿麗莉， 向殿軍. 納豆菌培養(yǎng)條件的初步研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學刊，2008(8): 51-53.

[18] 王陽， 張景， 陳聰， 等. 納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)低分子大豆蛋白肽的工藝優(yōu)化[J]. 大連工業(yè)大學學報， 2012， 31(3): 161-164.

[19] 叢俊英， 張淑蓮， 王陽， 等. 納豆菌發(fā)酵魚肉蛋白制備低分子肽的工藝研究[J]. 大連工業(yè)大學學報， 2011， 30(6): 416-419.

[20] KUBO Y， INAOKA T， HACHIYA T， et al. Development of a rifampicin-resistant Bacillus subtilis strain for natto fermentation showing enhanced exoenzyme production[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2013， 115(6): 654-657.

Effects of Different Conditions on Free Amino Nitrogen Content and Nattokinase Activity in Bacillus natto-Fermented Clam

WANG Wenxiu， YU Jia， LI Shan， WEI Yuxi*， SONG Huiping， XU Lina
(College of Life Science， Qingdao University， Qingdao 266071， China)

The optimization of conditions for clam fermentation with Bacillus natto for improved free amino nitrogen content and nattokinase activity was conducted by the combined use of single factor method and orthogonal array design. The maximum free amino nitrogen content， representing a conversion rate of 71.10%， was obtained when the fermentation was performed at 43 ℃for 48 h with an inoculum amount of 0.6% and a solid-to-water ratio of 1:2 (m/V)， while the maximum nattokinase activity was achieved after 48 h of fermentation at 41 ℃ with an inoculum amount of 0.8% and a solid-to-water ratio of 1:3 (m/V).

clam; Bacillus natto; fermentation; free amino nitrogen; nattokinase activity

TQ464

A

1002-6630（2015）09-0113-04

10.7506/spkx1002-6630-201509021

2014-07-27

青島市科技計劃項目（13-1-3-73-nsh）；山東省自然科學基金項目（ZR2012DM014）

王文秀（1990—），女，碩士研究生，研究方向為海洋生物活性物質(zhì)。E-mail：624101589@qq.com

*通信作者：魏玉西（1964—），男，教授，博士，研究方向為海洋生物資源高值化利用。E-mail：yxwei@qdu.edu.cn