余曉燕，畢 陽(yáng)，李永才*，燕 璐，沈科萍，胡林剛，唐亞梅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘 肅 蘭州 730070）

Trichothecium roseum 蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)杏果抗黑斑病的作用機(jī)理

余曉燕，畢 陽(yáng)，李永才*，燕 璐，沈科萍，胡林剛，唐亞梅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘 肅 蘭州 730070）

研究非親和菌株粉紅單端孢（Trichothecium roseum）菌體蛋白激發(fā)子對(duì)杏果實(shí)抗黑斑病的誘導(dǎo)效果及其作用機(jī)理。以‘蘭州大接杏’為試材，通過(guò)處理后不同時(shí)間損傷接種杏果黑斑病菌（Alternaria alternata），研究T. roseum蛋白激發(fā)子對(duì)杏果實(shí)黑斑病抗病性的 誘導(dǎo)及其時(shí)效性，同時(shí)進(jìn)一步研究最佳處理質(zhì)量濃度對(duì)杏果實(shí)組織活性氧及抗性相關(guān)酶的影響。結(jié)果表明，T. roseum蛋白激發(fā)子處理可顯著抑制損傷接種杏果病斑的擴(kuò)展（P＜0.05），其中14.4 μg/mL蛋白激發(fā)子的控制效果最好，且誘導(dǎo)處理72 h時(shí)杏果產(chǎn)生最大抗性。T. roseum蛋白激發(fā)子處理后杏果組織O2—·的生成速率和H2O2含量分別在48 h和72 h出現(xiàn)明顯的峰值，同時(shí)處理的果實(shí)組織超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性均有所增強(qiáng)。T. roseum菌體蛋白激發(fā)子處理能顯著增強(qiáng)杏果組織的抗性，其可能是通過(guò)激發(fā)活性氧爆發(fā)和提高杏果實(shí)抗病性相關(guān)酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？梢?jiàn)T. roseum蛋白激發(fā)子可以作為一種有潛力的誘抗劑應(yīng)用于采后病害的控制。

粉紅單端孢菌；蛋白激發(fā)子；杏果實(shí)；活性氧；誘導(dǎo)抗病性；黑斑病

杏（Prunus armeniaca L.）原產(chǎn)我國(guó)，甘肅省為全國(guó)杏的主要產(chǎn)區(qū)，其中‘蘭州大接杏’以個(gè)大、色艷、氣香、味美、質(zhì)優(yōu)而久負(fù)盛名[1-2]。由于杏的成熟期集中，貨架期較短，常溫條件下的采后壽命只有3～4 d，低溫條件下也不足3周。此外，杏的采后 腐爛也頗為嚴(yán)重，其中由互隔交鏈孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病是低溫條件下杏的主要采后病害，該病原菌具有潛伏侵染的特性，對(duì)杏在低溫冷鏈物流期間的腐爛率影響很大，常常導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。采用化學(xué)殺菌劑可有效控制杏的黑斑病，但由于存在藥物殘留、環(huán)境污染、以 及病原物產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題而逐漸受到限制[6]。因此，開(kāi)發(fā)新型安全可持續(xù)的采后病害防腐技術(shù)便顯得十分必要。生物農(nóng)藥在綠色食品生產(chǎn)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮著積極作用，其中微生物源激發(fā)子的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[7]。該類(lèi)激發(fā)子按化學(xué)性質(zhì)分為蛋白類(lèi)、寡糖類(lèi)、肽類(lèi)、糖蛋白類(lèi)以及脂類(lèi)等，其中蛋白類(lèi)激發(fā)子又分為過(guò)敏蛋白、隱地蛋白、激活蛋白及其他蛋白，這些激發(fā)子均具有廣譜提高植物抗性、有效控制病害 的作用[8]。例如，用從極細(xì)鏈格孢菌（A. tenuissima）中獲得的蛋白激發(fā)子（Hrip1）處理煙草，能夠激活水楊酸途徑的蛋白激酶并且提高相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)[9]；將Hrip1基因轉(zhuǎn)入擬南芥，植株對(duì)灰霉病的抗性顯著增強(qiáng)[10]；將稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的蛋白激發(fā)子PemG1基因轉(zhuǎn)入水稻可提高植株對(duì)稻瘟病的抗性[11]；將梨火疫病菌（Erwinia amylovora）產(chǎn)生的過(guò)敏蛋白Harpin基因?qū)腭R鈴薯可提高對(duì)晚疫病的抗性[8]，用Harpin處理蘋(píng)果和甜瓜可有效提高果實(shí)的抗病性[12-13]。雖然蛋白類(lèi)激發(fā)子在控制植物病害中的作用已有一些研究，但 多集中于田間病害，尚未見(jiàn)T. roseum源蛋白類(lèi)激發(fā)子在果實(shí)上的應(yīng)用報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬以‘蘭州大接杏’為試材，研究T. roseum菌體蛋白激發(fā)子處理對(duì)Alternaria alternata挑戰(zhàn)接種杏果黑斑病的控制效果；探索處理后果實(shí)O2—·產(chǎn)生速率和H2O2含量的積累，以及主要抗氧化酶活性的變化；分析處理對(duì)果實(shí)病程相關(guān)蛋白的影響，以期為真菌源激發(fā)子在果蔬采后病害控制中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試‘蘭州大接杏’（Armeniaca vulgaris cv. Lam.）2013年7月采自甘肅省臨洮縣商業(yè)化杏園，采收后剔除傷、病果，選擇大小、果色均勻、八成熟的杏果實(shí)，5 h運(yùn)抵甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，0 ℃條件下貯藏待用。粉紅單端孢（T. roseum）由本實(shí)驗(yàn)室提供；互隔交鏈孢（A. alternata）分離于自然發(fā)病的杏果實(shí)，經(jīng)純化鑒定后馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上保存待用。

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 T. roseum菌體粗蛋白激發(fā)子的制備

參照Z(yǔ)hao Mingzhi等[14]方法稍有改動(dòng)，從低溫保存的種管挑取少量菌絲體，轉(zhuǎn)接到固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5 d后制備孢子懸浮液，按照1.5%（V/V）接種量接種到液體培養(yǎng)基，150 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)，7 d后真空抽濾用蒸餾水洗滌多次的菌體并獲得抽干菌體，—80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ【z體10 g置于液氮研磨成粉末，迅速加入40 mL蛋白提取液（20 mmo1/L Tris-HCl緩沖液pH 7.0，2 mmo1/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））振蕩混勻并提取1 h，沸水浴30 min后迅速冷卻，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，即為粗蛋白激發(fā)子。

1.2.2 孢子懸浮液配制

參照周德慶[15]方法。取28 ℃條件下培養(yǎng)7 d的A. alternata，加入含0.05% Tween 20的無(wú)菌水20 mL，用涂布棒刮下平板上的病原菌孢子，然后轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶中，在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15 s，再用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)算出孢子懸浮液的濃度后，最后稀釋至所需濃度（1×106孢子/mL）。

1.2.3 果實(shí)的處理

將果實(shí)分兩組，第1組分別用蒸餾水（CK）、144、14.4、1.44 μg/mL的粗蛋白激發(fā)子（以蛋白質(zhì)量濃度計(jì)）噴灑處理，并晾干表面水分別裝箱于常溫，處理后12、24、36、48、60、72 h的杏果用滅菌打孔器（直徑3 mm）在果實(shí)陰陽(yáng)面的赤道部位均勻刺孔2個(gè)（深約3 mm），待孔中果實(shí)汁液晾干后，分別接入20 μL A. alternata孢子懸浮液（1.0×106孢子/mL），晾干后將相同處理每3個(gè)裝入一個(gè)帶孔保鮮袋（厚0.01 mm），常溫（25±2） ℃貯藏，第3天觀察病斑并采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑。每個(gè)處理15 個(gè)杏果，重復(fù)3 次。

第2組分別用蒸餾水和最佳處理質(zhì)量濃度的粗蛋白激發(fā)子噴灑，晾干后裝箱置于2 ℃冷庫(kù)中。貯藏期間每隔12、24、48、72、96、120 h取3～5 mm果皮組織3 g（取樣前回溫1 h），用錫箔紙包好后立即用液氮進(jìn)行冷凍，然后保存于—80 ℃待用。

1.2.4 O2—·產(chǎn)生速率和H2O2含量的測(cè)定

O2—·產(chǎn)生速率的測(cè)定參考王云飛等[16]方法略修改。稱(chēng)取3 g果皮組織，加5 mL、pH 7.8、100 mmol/L磷酸緩沖液，在冰浴條件下研磨成漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取1 mL上清液，加入1 mL磷酸緩沖液和0.5 mL 10 mmol/L的鹽酸羥胺溶液，在25 ℃反應(yīng)1 h。然后加入1 mL 17 mmol/L對(duì)氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/L α-萘胺，于25 ℃保溫30 min。然后530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。以nmol/（min·g）表示O2—·產(chǎn)生速率，平行3次。

H2O2含量的測(cè)定參照高雄杰[17]方法略修改。稱(chēng)取3 g果皮組織，加入3 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的丙酮，冰浴條件下研磨成漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取1 mL上清液，加入100 μL 20%的四氯化鈦溶液和200 μL濃氨水，混勻反應(yīng)5 min后離心10 min。沉淀部分用經(jīng)4 ℃預(yù)冷的丙酮洗滌8 次，最后將沉淀溶于3 mL 1 mol/L H2SO4溶液中，于410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。以標(biāo)準(zhǔn)H2O2溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，H2O2含量以μmol/g表示，平行3 次。

1.2.5 超氧化物歧化酶（su peroxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性的測(cè)定

SOD活性的測(cè)定參考曹建康等[18]方法略有修改。稱(chēng)取3 g果皮組織，加入5 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的100 mmol/L磷酸緩沖液，在冰浴中充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液立即用于酶活性測(cè)定。于指形管中加入1.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液，300 ?L 130 mmol/L甲硫氨酸，300 ?L 750 ?mol/L氮藍(lán)四唑，300 ?L 100 ?mol/L EDTA-Na2，100 ?L粗酶液，最后加入300 ?L 20 ?mol/L核黃素，2支對(duì)照管以緩沖液代替酶液，混勻后將1支對(duì)照管置于暗處，其他各管于4 000 lx日光燈下反應(yīng)15 min。以不照光管做空白參比，于560 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各管的OD值?；钚砸院糠昼娒靠斯麑?shí)組織的反應(yīng)體系抑制氮藍(lán)四唑光化還原的50%為一個(gè)活力單位（U）計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

POD活性測(cè)定參照Bi Yang等[13]方法略修改。取3 g果皮組織，加入5 mL 50 mmol/L pH 5.9的磷酸緩沖液，在冰浴中充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液用于POD活性測(cè)定。酶促反應(yīng)體系為：1.8 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚、100 μL粗酶液和100 μL 2% H2O2，以蒸餾水作對(duì)照，2 min內(nèi)在470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值的變化，以每克果蔬樣品每分鐘光密度值增加1時(shí)為1個(gè)POD活性單位，其表示為ΔOD470nm/（min·g）。

PPO活性的測(cè)定參照任亞琳等[19]方法略修改。稱(chēng)3 g果皮組織，加入5 mL 50 mmol/L pH 5.5的磷酸緩沖液，在冰浴中充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液用于PPO活性測(cè)定。酶促反應(yīng)體系為：4 mL磷酸緩沖液、1 mL 50 mmoL鄰苯二酚、100 μL的酶提取液，以蒸餾水作參比，2 min內(nèi)在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值的變化，以每克果蔬樣品每分鐘光密度值增加1為1個(gè)PPO酶活性單位，其表示為ΔOD420nm/（min·g）。

1.2.6 β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）和幾丁質(zhì)酶（chitinas，CHT）活性的測(cè)定

CHT活性的測(cè)定參考曹建康等[18]方法并修改，稱(chēng)3 g果皮組織，加5 mL的29 mg EDTA、35 μL β-巰基乙醇、pH 5.2、50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，在冰浴中充分研磨，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，與5 倍體積的預(yù)冷丙酮混合，置于—20 ℃沉淀蛋白質(zhì)，離心收集沉淀，最后用氮?dú)獯蹈桑瑢⑵淙芙庥谔崛【彌_液中，同樣條件下離心收集上清，反應(yīng)酶體系為：0.5 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.5 mL 10 g/L膠狀幾丁質(zhì)懸浮液、0.5 mL的酶提取液，以滅活的酶液作對(duì)照。反應(yīng)管置于37 ℃反應(yīng)1 h，后加入0.2 mL 0.6 mol/L四硼酸鉀溶液，沸水浴中煮沸3 min，迅速冷卻，在585 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行操作，重復(fù)3 次。以每秒每克樣品中酶分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1× 10—6N-乙酰葡萄糖胺為一個(gè)CHT活性單位，單位是10—6mol/（s·g），計(jì)算見(jiàn)公式（2）：

式中：n為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的N-乙酰葡萄糖胺的量/μmol；V為樣品提取液總體積/mL；Vs為測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積/mL；t為酶促反應(yīng)時(shí)間/s；m為樣品質(zhì)量/g。GLU活性的測(cè)定參考曹建康等[18]方法并修改，稱(chēng)3 g果皮組織，加入預(yù)冷5 mL的29 mg EDTA、0.1 g/L抗壞血酸、35 μL β-巰基乙醇、pH 5.2、0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液，在冰浴中充分研磨，4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液用于活性測(cè)定。200 μL 4 g/L昆布多糖為底物，以每秒每克樣品中酶分解昆 布多糖產(chǎn)生1×10—3葡萄糖為一個(gè)GLU活單位，單位是10—3mol /（s·g），計(jì)算見(jiàn)公式（3）：

式中：m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的葡萄糖的質(zhì)量/mg；V為樣品提取液總體積/mL；Vs為測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積/mL；t為酶促反應(yīng)時(shí)間/s；m為樣品質(zhì)量/g；180為葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.7 蛋白含量測(cè)定

參照Brad ford[20]方法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重差異顯著分析和Excel 2007軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 激發(fā)子處理對(duì)杏果抗黑斑病的影響

激發(fā)子處理均可明顯降低杏果損傷接種A. alternata的病斑直徑（P＜0.05）（圖1），但不同質(zhì)量濃度激發(fā)子處理之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其中以14.4 μg/mL的處理效果較好。處理與損傷接種的間隔時(shí)間對(duì)病斑直徑的影響較大（P＜0.01），當(dāng)間隔48、60、72 h后病斑直徑僅分別為同期對(duì)照的53.3%、49.1%和35.5%，說(shuō)明不同處理時(shí)間而效果不同，誘導(dǎo)72 h時(shí)的抗病效果為處理組中最好。

圖1 T. roseum seum蛋白激發(fā)子處理對(duì)杏果抗黑斑病的影響Fig.1 Effect of treatment with protein elicitor from T. roseum on resistance in apricot fruits against Alternaria rot圖2 T.rosseeuumm蛋白激發(fā)子處理對(duì)杏果生成速率（aa）和H2O2含量（bb）的影響Fig.2 Effect of treatment with protein elicitor from T. roseum on· generation rate and H2O2content in apricot fruit tissue

2.2 激發(fā)子處理對(duì)杏果組織O2—·生成速率和H2O2含量的影響

圖1 T. roseum seum蛋白激發(fā)子處理對(duì)杏果抗黑斑病的影響Fig.1 Effect of treatment with protein elicitor from T. roseum on resistance in apricot fruits against Alternaria rot圖2 T.rosseeuumm蛋白激發(fā)子處理對(duì)杏果生成速率（aa）和H2O2含量（bb）的影響Fig.2 Effect of treatment with protein elicitor from T. roseum on· generation rate and H2O2content in apricot fruit tissue

2.3 激發(fā)子處理后對(duì)杏果組織SOD、POD、PPO活性的影響

激發(fā)子處理能顯著提高杏果組織SOD、POD和PPO的活性（圖3）。在處理后12 h內(nèi)，處理組和對(duì)照組果實(shí)SOD活性無(wú)明顯變化，之后處理組活性逐漸上升，48 h達(dá)到最大值，后期逐漸下降，而對(duì)照組在24 h之后呈先下降后上升趨勢(shì)，且在48 h處理組SOD活性比對(duì)照組高出2.25 倍（圖3a）；對(duì)照組或處理組果實(shí)的POD活性均呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，但在12 h后處理組POD活性顯著高于對(duì)照，在72 h達(dá)到最大值，其活性為對(duì)照的1.5 倍（圖3b）；處理組果實(shí)的PPO活性也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，尤其在處理48 h后，其活性顯著高于對(duì)照，且為對(duì)照的3.86 倍，而對(duì)照組隨時(shí)間的變化不大（圖3c）。

圖 3 T. rseum蛋白激發(fā)子處理對(duì)杏果組織SOD（a）、PODD（bb）、PPO（c）活性的影Fig.3 The activities of SOD (a), POD (b) and PPO (c) in apricot fruit tissue treated with protein elicitor from T. roseum

2.4 激發(fā)子處理后對(duì)杏果組織GLU和CHT活性的影響

激發(fā)子處理均能有效提高杏果組織GLU、CHT的活性（圖4）。杏的GLU活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在12 h后處理組GLU活性高于對(duì)照組，72 h達(dá)到最大值，其活性是對(duì)照的1.3 倍（圖4a）；在120 h內(nèi)處理組果實(shí)CHT活性明顯高于對(duì)照，且活性呈上升趨勢(shì)，在120 h處理組果實(shí)的CHT活性最大，為對(duì)照的2 倍（圖4b）。

圖4 4 T. roseum seum蛋白激發(fā)子處理對(duì)杏果組織GLU（a）和CHT（b）HTb活性的影響Fig.4 The activities of GLU (a) and CHT (b) in apricot fruit tissue treated with protein elicitor from T. roseum

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，T. roseum菌體粗蛋白激發(fā)子可顯著抑制‘蘭州大接杏’損傷接種A. alternate病斑直徑的擴(kuò)展，促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)，增強(qiáng)SOD、POD和PPO的活性以及病程相關(guān)（pathogenesis related，PR）蛋白的積累，從而誘導(dǎo)了果實(shí)的抗病性。不同質(zhì)量濃度激發(fā)子對(duì)果實(shí)抗病性的誘導(dǎo)效果存在差異，其中14.4 μg/mL的誘導(dǎo)效果較好。處理與損傷接種間隔時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)效果影響較大，以間隔72 h時(shí)效果最好。該結(jié)果與前人在使用Harpin處理甜瓜[13]和甜橙[21]的結(jié)果類(lèi)似，此外，真菌源蛋白激發(fā)子采前處理還可誘導(dǎo)葡萄對(duì)采后病害的抗性[22]。由此表明，微生物源蛋白激發(fā)子具有誘導(dǎo)果蔬抗病性的潛力，一定程度上可抑制采后病害的發(fā)生和發(fā)展。

ROS可使寄主產(chǎn)生多種抗性反應(yīng)，如細(xì)胞壁加厚、過(guò)敏性細(xì)胞死亡、抗性基因的激活以及抗性物質(zhì)的累積[23]。氧爆發(fā)是植物細(xì)胞對(duì)病原菌侵染和激發(fā)子處理后產(chǎn)生的一種重要早期事件[24]。本研究結(jié)果顯示，T. roseum菌體粗蛋白激發(fā)子導(dǎo)致了杏果實(shí)O2—·產(chǎn)生速率和H2O2含量短暫而快速的升高，O2—·在處理后48 h達(dá)到最大 值，SOD活性也在48 h迅速增加，同時(shí)72 h時(shí)H2O2含量達(dá)到最大值，這可能是激發(fā)子處理后杏產(chǎn)生的O2—·在SOD作用下可迅速轉(zhuǎn)化成H2O2，而在96 h處O2—·大量生成可能與其衰老有關(guān)。類(lèi)似的研究[9,25]報(bào)道表明，真菌源蛋白激發(fā)子處理可短暫而快速的生成大量H2O2、NO，且激發(fā)煙草、水稻等抗病性增強(qiáng)?？梢?jiàn)氧爆在介導(dǎo)微生物源激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗病性中具有重要作用，近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)ROS尤其是H2O2在植物SAR中可能是作為信號(hào)傳導(dǎo)分子而發(fā)揮作用[26]，其中位于原生質(zhì)膜上的NADPH氧化酶利用NADPH作為電子供體，通過(guò)還原O2能夠催化O2—·的產(chǎn)生，是植物氧爆過(guò)程中產(chǎn)生ROS的主要來(lái)源[27]。這些結(jié)果表明，蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)可產(chǎn)生大量的ROS，其可能在激發(fā)子誘導(dǎo)的杏采后抗病反應(yīng)中起到了重要作用，但是NOX與前期ROS產(chǎn)生的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

盡管ROS在增強(qiáng)植物的抗病性中有著重要的作用，然而植物體內(nèi)積累的ROS含量過(guò)高時(shí)就會(huì)對(duì)植物組織造成毒害作用，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、損傷 膜脂和膜蛋白、加速植物衰老等[28]，為了避免ROS的傷害，植物形成了自己的抗氧化系統(tǒng)使ROS不能過(guò)量積累。本結(jié)果顯示T. roseum激發(fā)子能誘導(dǎo)杏果SOD、POD及PPO的活性增加，在蛋白激發(fā)子處理番茄葉片[29]和棉花葉片[30]時(shí)也觀察到這一現(xiàn)象?？梢?jiàn)SOD作為調(diào)控ROS的關(guān)鍵酶，可通過(guò)催化組織內(nèi)O2—·快速轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2。而POD可通過(guò)氧化酚類(lèi)物質(zhì)分解H2O2，與對(duì)照相比激發(fā)子處理的杏果其POD在72 h顯著增加，由此表明在H2O2大量生成的時(shí)候，其PO D的活性也隨之增強(qiáng)達(dá)到保護(hù)杏的抗氧化能力。同時(shí)POD和PPO活性增加可促進(jìn)果實(shí)木質(zhì)素合成，木質(zhì)化不僅形成抵御病原菌侵入的物理屏障物，而且PPO可利用O2將酚類(lèi)物質(zhì)氧化形成的醌類(lèi)物質(zhì)對(duì)病原菌也有很強(qiáng)的毒害作用[31]。PPO的活性隨著處理時(shí)間而增強(qiáng)，在處理期間48 h時(shí)其活性最強(qiáng)。類(lèi)似報(bào)道表明，Harpin處理可誘導(dǎo)甜瓜POD活性增強(qiáng)[13]；真菌源激發(fā)子處理誘導(dǎo)水稻、番茄的PPO和POD活性增強(qiáng)從而提高抗性[25,32]。這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激發(fā)子處理植物和果實(shí)組織后其體內(nèi)ROS水平和一系列抗性相關(guān)酶SOD、POD、PPO活性之間的平衡關(guān)系來(lái)維持自身的抗病性，同時(shí)也可能因?yàn)镻PO利用ROS使細(xì)胞壁加厚有關(guān)，抵御病原物侵入。

激發(fā)子被識(shí)別后，信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)被激活、胞內(nèi)相關(guān)基因重編碼，與此同時(shí)具有PR功能蛋白也被激活表達(dá)[33]。本研究顯示，激發(fā)子處理后杏GLU和CHT活性較對(duì)照組均有顯著增加，隨著處理時(shí)間的推移其活性逐漸增強(qiáng)。與此類(lèi)似的報(bào)道表明，Harpin處理可誘導(dǎo)甜瓜CHT活性增強(qiáng)[13]，目前未見(jiàn)真菌源激發(fā)子誘導(dǎo)植物組織產(chǎn)生PR蛋白的報(bào)道。這可能由于激發(fā)子被識(shí)別后產(chǎn)生ROS，其作為信號(hào)分子激活了果實(shí)體內(nèi)的SA積累，誘導(dǎo)一系列抗氧化酶活性的變化，同時(shí)激活了GLU和CHT的大量表達(dá)，從而誘導(dǎo)杏的抗病性。因此該蛋白激發(fā)子處理后誘導(dǎo)杏果抗病性過(guò)程中產(chǎn)生的ROS與GLU、CHT可通過(guò)SA聯(lián)系起來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

T. roseum菌體粗蛋白激發(fā)子處理能顯著降低接 種A. alternate‘蘭州大接杏’杏果病斑直徑的擴(kuò)展。其中14.4 μg/mL的蛋白激發(fā)子抗病效果最顯著，72 h時(shí)抗病效果最好。用激發(fā)子處理后有短暫而大量的ROS產(chǎn)生，并誘導(dǎo)了杏果抗性相關(guān)酶SOD、PPO、POD、CHT、GLU等活性的提高。由此表明，T. roseum菌體粗蛋白激發(fā)子處理可通過(guò)影響果實(shí)ROS及抗性相關(guān)酶來(lái)增強(qiáng)杏對(duì)采后病害的控制。激發(fā)子一般是通過(guò)早期信號(hào)被激活、影響能量代謝最后通過(guò)苯丙烷代謝過(guò)程形成抗性相關(guān)物質(zhì)來(lái)體現(xiàn)其誘導(dǎo)抗性，因此本實(shí)驗(yàn)杏抗病性的研究中需進(jìn)一步系統(tǒng)研究能量及苯丙烷代謝過(guò)程進(jìn)一步闡述其誘導(dǎo)抗性作用機(jī)理；同時(shí)需進(jìn)一步純化菌體粗蛋白，研究何種蛋白在抗性中起關(guān)鍵性作用。

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Mechanism of Alternaria Rot Resistance Induced in Apricot Fruits by Protein Elicitor from Trichothecium roseum

YU Xiaoyan, BI Yang, LI Yongcai*, YAN Lu, SHEN Keping, HU Lingang, TANG Yamei
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The effect of protein elicitor from the nonhost Trichothecium roseum on black rot of apricot fruits and its possible induction mechanisms were studied. The inductive effect and its time-dependent manner of the protein elicitor in apricot fruits inoculated with Alternaria alternate at different times after treatment were studied. The effect of selected optimum concentration of protein elicitor on reactive oxygen species (ROS) and resistance-related enzymes in apricot fruit tissue were also evaluated. The lesion development of wound-inoculated apricot fruits were signifi cantly reduced by protein elicitor treatment(P < 0.05), and at 72 h after treatment with 14.4 μg/mL protein elicitorthe best induction effect on apricot fruits was observed. The rate of superoxide anion (O2-?) production and the content of hydrogen peroxide (H2O2) in fruit tissue reached the peak at 48 and 72 h, respectively. The activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), β-1,3-glucanase (GLU) and chitinase (CHT) in apricot fruit tissue treated with the protein elicitor were also increased. The protein elicitor treatment could signifi cantly increase the disease resistance of apricot fruit tissue, and the possible mechanism might be due to the outburst of RO S and the improved activities of resistance-related enzymes. So protein elicitor from Trichothecium roseum may be a potential resistance inducer and can be further applied to postharvest diseases control.

Trichothecium roseum; protein elicitor; apricot fruit; reactive oxygen species; induced disease resistance; Alternaria rot

TS201.3

A

1002-6630（2015）04-0254-06

10.7506/spkx1002-6630-201504050

2014-04-21

甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專(zhuān)項(xiàng)（GNSW-2011-11）

余曉燕（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)椴珊笊飳W(xué)與技術(shù)。E-mail：y198808150028@163.com

*通信作者：李永才（1972—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣卟珊笊飳W(xué)與技術(shù)。E-mail：liyongcai@gsau.edu.cn