劉正才，張 瓊，楊 方，林永輝，劉素珍，蘇芝嬌

（福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州 350001）

親水作用色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法測定水產(chǎn)品中的氟苯尼考胺的殘留量

劉正才，張 瓊，楊 方，林永輝，劉素珍，蘇芝嬌

（福建出入境檢驗檢疫局 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州 350001）

建立親水作用色譜-電噴霧串聯(lián)質譜測定水產(chǎn)品中氟苯尼考胺殘留量的測定方法。樣品用堿性乙酸乙酯提取，以正己烷和脂肪吸附材料去除油脂，用5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）和乙腈作為流動相，以梯度洗脫方式在Acquity UPLC BEH HILIC柱（55 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱上分離，以電噴霧離子源正離子模式進行質譜分析，基質外標法定量。結果表明，氟苯尼考胺的質量濃度在0.1～20 ?g/L范圍內呈良好的線性，相關系數(shù)（r2）大于0.990。在1.0 ～50.0 ?g/kg加標水平下，蝦、黃魚、鰻魚、烤鰻的平均回收率為70.5%～87.7%，相對標準偏差為4.8 %～11.6%，定量限為1.0 ?g/kg。該方法簡單、靈敏、穩(wěn)定，可滿足水產(chǎn)品中氟苯尼考胺殘留量的檢測和確證需要。

親水作用色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法；水產(chǎn)品；氟苯尼考胺；殘留檢測

氟苯尼考胺（florfenicol amine，F(xiàn)FA）是一種氯霉素類抗生素藥物氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）的主要代謝產(chǎn)物[1-2]，隨著FF在水產(chǎn)養(yǎng)殖上大量、不規(guī)范應用，它在水產(chǎn)品中的抗藥性和殘留問題也日益被重視，影響水產(chǎn)品質量安全[3-4]，因此，中國、歐盟及美國均對水產(chǎn)品中FF的最大殘留量（100 ?g/kg）進行了規(guī)定并以FF和FFA的濃度之和作為標示殘留物[5]。目前對FF的檢測比較成熟[4-12]，我國也發(fā)布了相關的檢測標準[13-16]，而單獨對其代謝物FFA的研究較少。

目前有文獻報道的檢測方法多為酶聯(lián)免疫法[7]、毛細管電泳法[8]、高效液相色譜法[9-11]、氣相色譜-質譜法[12,17]、液相色譜-質譜法[18-20]等；酶聯(lián)免疫法為定性方法，不能準確定量；高效液相色譜法具有簡單快速的特點，較難滿足國內外對FFA的殘留限量要求；氣相色譜-質譜法雖然靈敏度較高，可以滿足檢測要求，但需要對樣品進行衍生，方法繁瑣，干擾多；文獻[12,17-18]采用液相色譜-質譜法需要采用不同的電離模式，而正負離子切換模式會使靈敏度降低，并且都較少對基質效應進行考察，另外，國家標準[16]以及文獻[10,18-20]報道的方法對FFA分離主要采用以C8和C18為固定相的色譜柱，對極性較強的FFA保留能力差，存在拖尾等缺點。因此，研究檢測水產(chǎn)品中的FFA殘留量的檢測方法是十分必要的。親水作用色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）法分離強極性化合物是近年來色譜研究的熱點領域之一[21-23]。HILIC能有效地解決強極性化合物在反相色譜中保留弱或難以保留的問題，而且易于實現(xiàn)與質譜的聯(lián)用，近年來廣泛應用于極性化合物、離子型、堿性化合物的分離。本研究是在標準方法[16]的基礎上進行改進，利用FFA的堿性離子型化合物特性，結合親水相互作用液相色譜技術，建立了快速簡便、高效準確地測定水產(chǎn)品中FFA的液相色譜-串聯(lián)質譜方法，方法操作簡便、靈敏度優(yōu)于文獻[18,20]報道，滿足中國、歐盟、美國等對氟苯尼考殘胺留限量檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用鰻魚、蝦、黃魚購自于福州水產(chǎn)品市場；烤鰻 送檢樣品。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 德國默克公司；其余試劑為分析純，水為去離子水；氟苯尼考胺標準品（純度≥99.0%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；LAS脂肪吸附材料（粒徑60 μm） 大連思譜精工有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultra performance LC/Quattra Premier超高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（配電噴霧電離源） 美國Waters公司；TDL-40B低速臺式離心機 廈門精藝興業(yè)科技有限公司；HN200多功能氮吹儀 海能儀器公司；去離子水發(fā)生器 美國Milli-Q公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

氟苯尼考胺標準儲備液（100 μg/mL）：稱取經(jīng)折算相當于10 mg（精確到0.01 mg）的標準物質，用水溶解后以甲醇定容至100 mL容量瓶中。置于具塞試劑瓶中于－4 ℃冷藏保存。標準工作液：用陰性樣品提取液稀釋氟苯尼考胺儲備液，分別配成氟苯尼考胺質量濃度為0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ng/mL的標準工作液，該工作液在4 ℃條件下可保存2 周。

1.3.2 樣品制備

蝦去殼后取可食部分、鰻魚去皮和骨后取肌肉部分，攪成勻漿；烤鰻先用水洗去外面的醬油等添加物，然后取肌肉部分，攪成勻漿，于－18 ℃冷凍保存。

1.3.3 提取

稱取試樣5 g（精確到0.1 g）于50 mL具塞塑料離心管中；其余提取步驟參見標準GB/T 22959—2008《河豚魚、鰻魚和烤鰻中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定：液相色譜-串聯(lián)質譜法》[16]，以含氨水乙酸乙酯混合溶液（3∶97，V/V）提取，定容至50 mL容量瓶中，分取10.0 mL乙酸乙酯，于45 ℃減壓旋轉濃縮至干。

1.3.4 凈化

加入2.00 mL 水溶解玻璃離心管中氮吹后的殘渣，旋渦振蕩混勻，超聲波功率100 W超聲5 min，加入3 mL正己烷旋渦振蕩混合30 s，4 500 r/min離心3min后用一次性吸管移去上層的正己烷，再加入2.00 mL乙腈和0.2 g LAS脂肪吸附材料，旋渦振蕩混勻30 s后取上清液過0.2 μm水性濾膜至樣品瓶中供液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.3.5 儀器參數(shù)與測定條件

液相色譜條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH HILIC柱（55 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動相A：5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%）甲酸，B：乙腈，流速0.30 mL/min。梯度洗脫：0～2 min，流動相A由5%線性增至20%；2～2.5 min，由20%線性增至90%，3 min時線性降至5%并保持至5 min；柱溫：室溫；進樣量：5 μL。

質譜條件：電噴霧電離源；正離子掃描；離子源溫度：450 ℃；錐孔電壓：18 V；掃描方式：多離子反應監(jiān)測；母離子m/z 248.5；定量離子m/z 230.2，碰撞能量13 eV；定性離子m/z 130.2，碰撞能量20 eV。

液相色譜-串聯(lián)質譜測定：將FFA基質標準工作溶液在設定條件下分別進樣，以定量離子峰面積y為縱坐標，F(xiàn)FA含量（ng/mL）為橫坐標x，繪制標準工作曲線。用該標準工作曲線對樣品進行定量，樣品溶液中FFA的響應值應均在儀器測定的線性范圍內。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

氟苯尼考胺含氮基，在ESI源中很容易得到其帶一個正電荷的母離子（m/z 248，[M+H]），碰撞分裂后，產(chǎn)生2 個特征定性離子（m/z 230，[M+H—H2O]）、m/z 130，[M+H—H2O—HF—（HSO2-CH3）]。其中m/z 230 豐度值大，受雜質干擾小，選做定量離子。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

氟苯尼考胺為堿性化合物，極性較強，普通的C18色譜柱不容易保留，采用液相色譜分析法通需要在流動相中添加離子對試劑，但不能與質譜聯(lián)用。HILIC以親水性的硅膠鍵合相、極性聚合物填料或離子交換吸附劑為固定相，兼有反相色譜和離子色譜的雙重特性，對在反相色譜柱上無保留的強極性化合物有較好的保留作用。采用HILIC親水作用色譜柱對FFA進行分離，對流動相進行梯度洗脫實驗發(fā)現(xiàn)，流動相的起始比例有機相如果高于30%，F(xiàn)FA峰形反而變寬，相應值變小，這與經(jīng)典的HILIC分離模式相反，可能由于FFA在酸性溶液中以離子型態(tài)存在，高有機相會抑制FFA離子的形成。本方法采用Acquity UPLC BEH HILIC親水作用色譜柱，以5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）和乙腈作為流動相，可以得到較好的分離，氟苯尼考胺的保留時間為2.30 min。

2.3 提取與凈化條件的優(yōu)化

氟苯尼考胺微溶于水，在堿性條件下溶于有機溶劑，實驗用65%乙腈、46%丙酮、94%乙酸乙酯、75%二氯甲烷等有機溶劑同時提取作比較，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的提取效率最好，因此選用堿性乙酸乙酯進行超聲振蕩提取。采用乙酸乙酯對水產(chǎn)品提取時，有大量的油類、脂質及類脂質同時被提取出來，尤其是鰻魚和烤鰻，需去除這類脂溶性雜質。目前文獻[12,17-18]報道的主要是用正己烷和陽離子交換性質的SPE進行凈化，實驗發(fā)現(xiàn)即使采用正己烷進行多次凈化也不能完全除去油脂類雜質，在質譜分析中依然有較大的基體抑制；而采用SPE凈化則過程復雜，且成本較高。文獻[24]報道強疏水性材料LAS對蛋白和脂肪都有較強的吸附性，本實驗以純水進行復溶解，先用3 mL正己烷除去非極性的油脂雜質，然后加入等量的乙腈稀釋后再用0.2 g LAS材料吸附蛋白和脂肪類有機雜質，可以獲得滿意的結果。

2.4 基質效應的考察

圖1 氟苯尼考胺在不同基質的基質校正曲線Fig.1 Matrix extract calibrations of FFA in different matrixes

實驗中發(fā)現(xiàn)，對所驗證的基質樣品，使用溶劑校正曲線校正加標結果時，回收率都為30%～50%左右，即使用空白基質溶液稀釋標準溶液，響應值也會降低很多，說明存在較為嚴重的基質抑制效應。對其進行基質效應的考察，基質抑制效應采用（基質匹配標準溶液所作曲線的斜率/無基質標準溶液所作曲線的斜率—1）×100進行評價[25]，分別對基質匹配曲線和溶劑（10%乙腈溶液）匹配曲線作圖（圖1）。可以看出，如果不進行LAS材料凈化處理而只用正己烷簡單的除脂，黃魚（—30.4%）、蝦（—39.9%）、鰻魚（—50.5%）、烤鰻（—68.5%）4 種基質存在非常明顯的基質抑制效應，而加入乙腈稀釋定容液再加入LAS材料凈化后，基質效應分別為黃魚—10.8%、蝦—12.6%、鰻魚—24.5%、烤鰻—27.2%。由于沒有相應的同位素內標，本方法通過稀釋樣品溶液和基質匹配標準溶液校準方法來消除基質效應的影響。

2.5 線性方程、檢出限、定量限

在本方法所確定的實驗條件下，4 種基質樣品的基質校正曲線的線性方程、相關系數(shù)如表1所示。根據(jù)儀器的信噪比RSN不小于3時的相應值，結合方法的前處理過程，本方法的檢出限為0.5 ?g/kg；按照RSN不小于10時的相應值計算定量限，本方法的定量限為1.0 ?g/kg。

表1 線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table1 Linear equations, correlation coefficients (Table1 Linear equations, correlation coefficients (r2), limits ofof detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) detection (LOD) and limits of quantification (LOQ)

2.6 方法回收率和精密度

表2 蝦、黃魚、鰻魚、烤鰻基質中FFA在4個添加水平下的平均回收率以及精密度（n=6）=6Table2 Average recoveries and relative standard deviations of FFA at Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of FFA at four spiked levels in shrimp, yellow croaker, eel, and eel product ( four spiked levels in shrimp, yellow croaker, eel, and eel product (n = 6) = 6)

圖2 不同空白樣品以及加標水平為1.0 ?g/kg樣品中FFA的MRM色譜圖Fig.2 Chromatograms of (a) blank sample and (b) blank sample spiked with FFA at 1.0 ?g/kg under MRM mode

以不含氟苯尼考胺的蝦、黃魚、鰻魚、烤鰻為基質，按照前面的提前凈化步驟進行4 個添加水平的添加回收實驗，每個樣品基體和每個添加水平重復測定6 次，回收率與精密度見表2。由表2可見，4 種添加水平下的平均回收率在70.5%～87.7%之間，相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）在4.8%～11.6%之間。說明方法的準確度高，通用性好，其標準色譜圖見圖2。

2.7 實際樣品的檢測

采用本方法對送檢本實驗室的蝦、黃魚、鰻魚、烤鰻等樣品進行檢測，檢測共84 個樣品，結果顯示，4 個烤鰻樣品檢出氟苯尼考胺，含量為1.0～100 ?g/kg。

3 結 論

上述結果表明，所建立的親水作用色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法具有較低的定量限和較好的重復性，該方法簡單、快速、操作簡單、適用性強，適合于水產(chǎn)品中氟苯尼考胺的日常檢測。

[1] STEFAN S, CORINNA K, AXEL C, et a1. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicol[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2004, 28(5): 519-542.

[2] GAIKOWSKI M P, MUSHTAQ M, CASSIDY P, et a1. Depletion of florfenicol amine, marker residue of florfenieol, from the edible fillet of tilapia following florfenicol administration in feed[J]. Aquaculture, 2010, 301: 1-6.

[3] 徐力文, 廖昌容, 劉廣鋒. 氟苯尼考用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的安全性[J]. 中國水產(chǎn)科學, 2005, 12(4): 512-5l8.

[4] 劉明生, 甘輝群, 劉俊棟. 雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的檢測技術研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2012, 40(1): 253-254.

[5] European Commission. EC 1490/2003 Establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin[S]. 2003.

[6] 蔡欣欣, 張秀堯. 超高效液相色譜三重四極桿質譜法快速測定動物源食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2009, 19(2): 258-260.

[7] 劉智宏, 黃耀凌, 汪霞, 等. 水產(chǎn)品中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺酶聯(lián)免疫多殘留測定[J]. 中國獸藥雜志, 2010, 44(12): 1-5.

[8] HILLAERT S, van den BOSSCHE W. Optimization and validation of a micellar electrokinetic chromatographic method for the analysis of florfenicol[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 36(3): 437-440.

[9] 楊方, 方宇, 劉正才, 等. 液相色譜-熒光檢測法檢測水產(chǎn)品中甲砜霉素、氟甲砜霉素及其代謝物氟甲砜霉素胺殘留[J]. 中國獸藥雜志, 2008, 42(8): 13-16.

[10] 謝愷舟, 姚宜林, 徐東. 高效液相色譜熒光檢測法同時檢測雞蛋中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留[J]. 中國獸藥雜志, 2011, 47(8): 74-77.

[11] 陳玲珍, 楊洪生, 吳光紅, 等. 高效液相色譜-熒光法測定水產(chǎn)品中氟苯尼考的殘留量[J]. 理化檢驗: 化學分冊, 2010, 46(6): 654-659.

[12] SHEN J Z, XIA X, JIANG H Y. Determination of chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol, and florfenicol amine in poultry and porcine muscle and liver by gas chromatography-negative chemical ionization mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2009, 877(14/15): 1523-1529.

[13] 中國國家標準化管理委員會. GB/T 20756—2006 可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定: 液相色譜-串聯(lián)質譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2006.

[14] 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. SN/T 1865—2007 進出口動物源食品中甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的檢測方法: 液相色譜-串聯(lián)質譜法[S].北京: 中國標準出版社, 200 7.

[15] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部958號公告-13—2007 水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測定: 氣相色譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2007.

[16] 中國國家標準化管理委員會. GB/T 22959—2008 河豚魚、鰻魚和烤鰻中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定: 液相色譜-串聯(lián)質譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[17] LI Peng, QIU Yueming, CAI Huixia, et al. Determination of chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol residues in animal tissues by gas chromatography/mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2006, 24(1): 14-18.

[18] 李瑩瑩, 宋永青, 趙榕, 等. 液質聯(lián)用檢測魚肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的殘留量[J]. 食品科學, 2010, 31(12): 219-222.

[19] 楊洪生, 孟勇, 張美琴, 等. 快速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定水產(chǎn)品中氯霉素和氟苯尼考[J]. 理化檢驗: 化學分冊, 2012(11): 1353-1356.

[20] LUO P, CHEN X, LIANG C. Simultaneous determination of thiamphenicol, florfenicol and florfenicol amine in swine muscle by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with immunoaffinity chromatography clean-up[J]. The Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2010, 878(2): 207-212.

[21] 王媛, 顧惠新, 路鑫, 等. 以親水作用色譜為核心的液相色譜聯(lián)用技術及其應用研究[J]. 色譜, 2008, 26(6): 649-657.

[22] 王煉, 龐晶晶, 余輝菊. 超高效液相色譜法測定乳及乳制品中的三聚氰胺[J]. 分析試驗室, 2010, 29(4): 53-55.

[23] 呂水源, 井偉, 李小晶, 等. 親水作用色譜串聯(lián)質譜同時檢測食品接觸產(chǎn)品中三聚氰胺和三聚氰酸單體遷移量[J]. 食品科學, 2012, 33(16): 159-162.

[24] 魏杰, 郭志謀, 沈愛金, 等. 基于QuEChERS前處理技術和弱陽離子交換色譜的牛奶和奶粉中三聚氰胺的快速檢測方法[J]. 色譜, 2011, 29(7): 687-690.

[25] MATUSZEWSKI B K, CONSTANZER M L, CHAVEZ-ENG C M. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J]. Avnalytical Chemistry, 2003, 75: 3019-3030.

Determination of Florfenicol Amine in Aquatic Products by Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIU Zhengcai, ZHANG Qiong, YANG Fang, LIN Yonghui, LIU Suzhen, SU Zhijiao
(Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)

A method for the determination of florfenicol amine (FFA) in aquatic products was developed by hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (HILIC-MS-MS). Samples were extracted with alkalinified ethyl acetate and cleaned up with n-hexane and lipid adsorbent (LAS). An Acquity UPLC BEH HILIC (55 mm × 2.1 mm, i.d. 1.7 μm) colunm was used for the separation by gradient elution program using acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate containing formic acid (0.2%) as the mobile phase, and an electrospray ion trap mass spectrometer was used in the positive ion mode. The FFA was quantified by the matrix-matched external standard method. The results showed that the established method had a good linear correlation (r2＞ 0.990) in the range of 0.1–20 ?g/L. The average recoveries of FFA at spiked level of 1.0–50.0 ?g/kg were in the range of 70.5%–87.7% with relative standard deviations (RSDs) of 4.8%–11.6%. The limit of quantization (LOQ) was 1.0 ?g/kg. This method proved to be simple, sensitive, accurate, and suitable for the determination and confirmation of FFA in aquatic products.

hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (HILIC-MS-MS); aquatic products; florfenicol amine; residue determination

O657.63

A

1002-6630（2015）04-0198-04

10.7506/spkx1002-6630-201504039

2014-05-11

公益性行業(yè)（質檢）科研專項（201310143-02）；福建省科技項目（2012Y6001）

劉正才（1977—），男，高級工程師，碩士，研究方向為農(nóng)獸藥殘留分析。E-mail：liuzhengcai@gmail.com