劉 欣，張國叢，周興虎，祝長青，黃 明,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京肉制品加工產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；2.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北 石家莊 050041；3.南京佳邦食品有限公司，江蘇 南京 211225）

轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法的建立

劉 欣1，張國叢2，周興虎3，祝長青1，黃 明1,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京肉制品加工產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；2.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北 石家莊 050041；3.南京佳邦食品有限公司，江蘇 南京 211225）

為實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的標識管理，針對轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的品系特異性序列設(shè)計引物和TaqMan探針，建立轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性進行檢測。結(jié)果顯示：建立的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法能擴增出127 bp的產(chǎn)物，特異性強，靈敏度達到0.1%，約為40 個單倍體基因組拷貝，檢測重復(fù)性好，可成功應(yīng)用于實際樣品檢測。因此，建立的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆MON89788大豆及其制品的檢測。

轉(zhuǎn)基因大豆；MON89788品系；實時熒光PCR；品系特異性檢測；轉(zhuǎn)基因標識

自1996年轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化種植以來，每年都以驚人的速度發(fā)展，截至2012年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達到1.703億 hm2，幾乎是1996年（170萬 hm2）的100 倍[1]。轉(zhuǎn)基因作物在解決全世界日益嚴重的糧食危機的同時，也帶來了食品安全和環(huán)境安全方面的諸多爭議[2]。為了防止轉(zhuǎn)基因生物可能存在的安全性問題，許多國家和地區(qū)制定了包括轉(zhuǎn)基因生物標簽制度在內(nèi)的安全管理措施。我國于2001年發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，明確規(guī)定了在中國境內(nèi)銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物應(yīng)當(dāng)有明顯的標識[3]。

標識管理制度的實施依賴于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)包括蛋白質(zhì)檢測技術(shù)和核酸檢測技術(shù)。近些年來，基于核酸的實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）因其高靈敏度、高特異性、無污染、可定量等優(yōu)點，已成為主流的轉(zhuǎn)基因生物檢測方法。根據(jù)目標核酸的位置不同，PCR檢測策略可以分為4 種，即篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構(gòu)建特異性PCR檢測和品系特異性PCR檢測[4]。與前3 種方法相比，品系特異性PCR是檢測外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)DNA序列，具有非常高的特異性和準確性[5]，已經(jīng)成為目前轉(zhuǎn)基因檢測方法研究的重點，至今已經(jīng)有許多轉(zhuǎn)基因作物品系特異性檢測方法建立并應(yīng)用，如轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12和A5547-127[6]、轉(zhuǎn)基因大米KMD1[7]、轉(zhuǎn)基因玉米LY038[8]、轉(zhuǎn)基因油菜Topas 19/2[9]。

轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系是美國孟山都公司研發(fā)抗草甘膦大豆品種，已先后在美國、加拿大、日本和哥斯達黎加4 個國家商業(yè)化種植，并在菲律賓、澳大利亞、新西蘭、墨西哥等11 個國家和地區(qū)批準用于食品和飼料加工原料[10]。我國雖然不種植轉(zhuǎn)基因大豆，但是每年進口幾千萬噸轉(zhuǎn)基因大豆用于食品或飼料加工原料，轉(zhuǎn)基因大豆MON89788已于2011年批準進口我國用作加工原料[10]。本研究基于轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性序列設(shè)計引物和探針，建立轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的安全監(jiān)管，滿足轉(zhuǎn)基因標識的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因大豆MON89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因玉米MON810、T25、BT176、BT11，轉(zhuǎn)基因大米Bt63、KF6，轉(zhuǎn)基因油菜GT73、MS8，非轉(zhuǎn)基因大豆，質(zhì)粒標準分子pMD19TMON89788以及相關(guān)檢測樣品（大豆顆粒、豆腐干、豆粕、豆奶粉） 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心。

植物基因組DNA提取試劑盒（DNAsecure Plant Kit，目錄號：DP320-02） 北京Tiangen公司；TaqMan實時熒光定量PCR預(yù)混液FastStart Universal Probe Master（Rox，2×） 南京萊普泰生物科技有限公司；PCR引物與探針由上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

攪拌器 德國Vorwerk公司；雜交爐 德國GFL公司；J-E冷凍離心機 美國Beckman公司；Centrifuge 5417C微型離心機 德國Eppendorf公司；MB-102恒溫振蕩金屬浴 日本Bioer公司；C130-1230V手掌離心機 美國Labnet公司；NanoDrop 1000微量紫外分光光度計 美國Thermo公司；LightCycler 480 II實時熒光PCR擴增儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 制樣與DNA提取

固體樣品大豆顆粒、豆腐干、豆粕稱取約200 g樣品，在經(jīng)徹底清洗的合適粉碎裝置中，將樣品均質(zhì)為粉末顆粒大小約0.5 mm。粉碎器皿清洗的具體步驟為40 ℃含有清潔液的溫水中浸泡30 min，使用毛刷刷洗2 次，轉(zhuǎn)移至清水中使用干凈的毛刷刷洗4 次，用長流水沖洗10 min，吹風(fēng)機吹干或者自然風(fēng)干。

按照Tiangen試劑盒說明提取1～2 g樣品DNA，DNA純度應(yīng)符合PCR檢測要求。

1.3.2 實時熒光檢測方法的建立及優(yōu)化

根據(jù)GenBank上公布的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的基因序列（登錄號：FB572992.1），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計出轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性引物和探針，使用熒光基團FAM作為探針的發(fā)光基團，擴增長度為127 bp。引物和探針見表1。

表1 轉(zhuǎn)基因MON89788實時熒光PCR檢測方法的引物、探針Table1 Primers and probe for real-time PCR

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2～5 μL DNA模板（50～200 ng），12.5 μL FastStart Universal Probe Master（Rox，2×），正、反向引物和探針，去離子水補齊體積。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火1 min；45個循環(huán)。對兩個引物和探針濃度進行優(yōu)化，引物濃度優(yōu)化梯度為400、300、200、150 nmol/L，相應(yīng)探針濃度為引物濃度的一半，適宜的引物和探針濃度組合范圍根據(jù)Ct值、熒光強度和擴增曲線確定。

1.3.3 特異性檢測

以轉(zhuǎn)基因 大豆MON89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因玉米MON810、T25、BT176、BT11，轉(zhuǎn)基因大米Bt63、KF6和轉(zhuǎn)基因油菜GT73、MS8的基因組DNA為模板，每個樣品DNA稀釋至50 ng/μL，加入2 μL DNA進行轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測，同時設(shè)置陰陽性及空白對照，陽性對照為質(zhì)粒標準分子pMON89788，陰性對照為非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，空白對照為無菌水。

1.3.4 靈敏度檢測

將研磨好的純合MON89788品系大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆干粉按照質(zhì)量百分比進行混合，配制4個不同轉(zhuǎn)基因含量樣品，包括5%、1%、0.5%和0.1%。每個樣品DNA稀釋至10 ng/μL，加入5 μL DNA作為模板，進行轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測，每個樣品進行3次重復(fù)實驗，同時設(shè)置空白對照。

1.3.5 重復(fù)性檢測

將轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的陽性樣品分為3 個標本，進行實時熒光PCR擴增，實驗分為3 次進行，每次設(shè)置3 個平行。通過計算3 個標本Ct值的標準差（s）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）驗證實時熒光PCR檢測方法的重復(fù)性。

1.3.6 實際樣品檢測

應(yīng)用建立的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法，對江蘇進口的申報為含有轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的貨物以及出口或進行質(zhì)控的大豆及其加工品進行轉(zhuǎn)基因大豆MON89788檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總DNA的提取

使用試劑盒法提取植物樣品總DNA，利用NanoDrop 1 000微量紫外分光光度計測定DNA的純度和濃度，DNA的OD260nm/OD280nm接近1.8，初步判斷這些樣品DNA可以進行PCR檢測。

2.2 實時熒光PCR檢測方法的建立及條件優(yōu)化

圖1 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法引物與探針濃度優(yōu)化Fig.1 Optimization of primer and probe concentrations for event-specific real-time PCR

不同的引物和探針終濃度配比結(jié)果如圖1所示，引物與探針終濃度為150、150、75 nmol/L，200、200、100 nmol/L，300、300、150 nmol/L，400、400、200 nmol/L時均得到良好的擴增曲線，熒光強度依次增強，對應(yīng)的Ct值分別為30.69±0.14、28.82±0.11、27.19±0.03、25.14±0.14，Ct值間存在極顯著差異（P＜0.01），不同的引物和探針終濃度對實驗結(jié)果影響較大。在25 μL反應(yīng)體系中，引物與探針終濃度為400、400、200 nmol/L時，即加入1 μL正、反向引物（10 nmol/L）和0.5 μL探針（10 nmol/L），可獲得較高的擴增效率，擴增曲線呈典型的S型曲線。

2.3 實時熒光PCR檢測方法的特異性

對轉(zhuǎn)基因大豆MON89788、A2704-12、A5547-127、GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因玉米MON810、T25、BT176、 BT11，轉(zhuǎn)基因大米Bt63、KF6，轉(zhuǎn)基因油菜GT73、MS8的基因組DNA進行擴增。如圖2所示，只有轉(zhuǎn)基因大豆MON89788基因組DNA與陽性對照成功擴增出轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性序列，其他11 種DNA樣本及陰性對照、空白對照在45 個循環(huán)內(nèi)沒有出現(xiàn)實時熒光擴增曲線?？梢姡槍D(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性序列的引物與探針特異性良好。

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法特異性實驗結(jié)果Fig.2 The specificity of event-specific real-time PCR

2.4 實時熒光PCR檢測方法的靈敏度

圖3 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性實時熒光PCRR方法靈敏度實驗結(jié)果Fig.3 The limit of detection of event-specific real-time PCR

對不同的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788含量的樣品提取DNA，進行實時熒光PCR擴增。如圖3所示，使用實時熒光PCR方法檢測50 ng DNA模板中轉(zhuǎn)基因含量為5%、1%、0.5%和0.1%的樣品時，存在明顯的擴增曲線，所得Ct值分別為29.65±0.11、32.11±0.06、33.20±0.06、35.57±0.20，Ct值均小于36。結(jié)果表明當(dāng)轉(zhuǎn)基因含量為0.1%時擴增良好，即建立的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法靈敏度可達0.1%，根據(jù)大豆基因組DNA大小[11]（1 115 Mbp）計算，相當(dāng)于約40 個單倍體基因組拷貝，能滿足目前國際上的轉(zhuǎn)基因標識制度的需要[12]。

2.5 實時熒光PCR檢測方法的重復(fù)性

轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的陽性樣品分為3 個標本，進行轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性檢測，結(jié)果見表2，Ct值的標準差為0.12，CV為0.54% ，CV小于5%，在誤差允許范圍內(nèi)。說明建立的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法重復(fù)性好，檢測穩(wěn)定性好。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性實時熒光PPCCRR方法重復(fù)性實驗結(jié)果Table2 Repeattability of event-specific real-time PCR

2.6 實時熒光PCR檢測方法的實際應(yīng)用

應(yīng)用上述建立的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法，對江蘇進口的70 批申報為含有轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的貨物（大豆顆粒、豆粕）進行了檢測，所有樣品判斷為陽性的條件為Ct值小于36，Ct值大于36判斷結(jié)果為陰性，轉(zhuǎn)基因大豆MON89788檢測結(jié)果均為陽性，符合申報內(nèi)容。同時對出口或進行質(zhì)控的30 個大豆及其加工品（豆腐干、豆奶粉）進行轉(zhuǎn)基因大豆MON89788檢測，檢測結(jié)果均為陰性。

3 討論與結(jié)論

目前為止，已經(jīng)有8 種轉(zhuǎn)基因大豆品系（GTS40-3-2、A2704-12、MON89788、DP356043、DP305423、CV127、MON87701、MON87701×MON89788）被批準作為加工原料進入中國，各種與轉(zhuǎn)基因大豆相關(guān)的產(chǎn)品越來越多地進入市場，同時轉(zhuǎn)基因大豆及其制品的安全性問題也越來越受到人們的關(guān)注與討論。為了保障消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)，建立準確、高效、快速的轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)可以分為蛋白質(zhì)檢測技術(shù)和核酸檢測技術(shù)兩大類。蛋白質(zhì)檢測技術(shù)主要包括蛋白質(zhì)印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法等，存在檢測成本高、所需時間長、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差等缺點，目前該類檢測技術(shù)在實際工作中較少涉及；核酸檢測技術(shù)主要包括PCR技術(shù)、分子雜交技術(shù)和基因芯片檢測技術(shù)等，由于檢測靈敏度高、特異性強、適用范圍廣、操作簡便等原因已廣泛地應(yīng)用于各種轉(zhuǎn)基因食品的日常檢測中[13]。核酸檢測技術(shù)中的TaqMan實時熒光PCR技術(shù)實現(xiàn)了對整個PCR過程的實時監(jiān)測，省去了常規(guī)PCR中電泳等后續(xù)處理，有效解決了核酸的交叉污染問題，此外在PCR反應(yīng)體系中加入TaqMan探針，使得非特異性產(chǎn)物不能與探針雜交從而增加了檢測特異性，是目前應(yīng)用廣泛的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)[14]，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種轉(zhuǎn)基因植物的檢測[15-17]。

在轉(zhuǎn)基因植物中，外源插入DNA片段一般包括啟動子、目的基因和終止子3 類元件，因此針對PCR擴增的目標序列的不同，其檢測特異性也有很大差別。品系特異性PCR檢測是通過檢測外源插入DNA與植物基因組DNA的連接區(qū)序列實現(xiàn)的，由于外源插入載體的插入位點是唯一的，并且連接區(qū)序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測方法具有很高的特異性，能夠區(qū)分具有相同構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因品系[4-5]。本研究基于轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性序列建立了轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實時熒光PCR檢測方法，靈敏度為0.1%，約為40個單倍體基因組拷貝，與歐盟研究中心的MON89788檢測方法[18]相比更加靈敏，能夠滿足轉(zhuǎn)基因檢測需要，同時引物擴增片段長度短（127 bp），也適用于加工產(chǎn)品的檢測。另外該方法和Kim[19]、李飛武[20]等建立的品系特異性常規(guī)PCR方法相比，檢測靈敏度相近，操作簡便，省去了PCR后續(xù)的電泳步驟，避免了對人體有害的染色劑溴化乙錠等的使用，減少了造成污染和假陽性的機會。

本研究建立的用于轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異性檢測的TaqMan實時熒光PCR方法特異性強、靈敏度高，可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆MON89788及其制品的檢測，以滿足轉(zhuǎn)基因大豆MON89788的標識需要，值得推廣和使用。

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Establishment of Event-Specific Real-Time PCR Method for Detection of Genetically Modified Soybean MON89788

LIU Xin1, ZHANG Guocong2, ZHOU Xinghu3, ZHU Changqing1, HUANG Ming1,*
(1. Nanjing Innovation Center of Meat Products Processing, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Shijiazhuang Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050041, China; 3. Nanjing Jiabang Food Co. Ltd., Nanjing 211225, China)

For implementation of labeling regulations, an event-specific real-time PCR method for the detection of genetically modified soybean MON89788 was established in this study. Primers and TaqMan probe were designed based on the event-specific sequence of MON89788 soybean. The specificity, sensitivity and repeatability of the developed method were examined, respectively. The results showed that the method could amplify a 127 bp product specifically; the limit of detection was 0.1% in 50 ng of soybean genomic DNA, approximately corresponding to 40 soybean haploid genome copies; and this method had good repeatability and could be successfully applied to the detection of real samples. These results indicated that the strain-specific real-time PCR method was suitable for the identification of genetically modified soybean MON89788 and its products.

genetically modified soybean; MON89788 event; real-time PCR; event-specific detection; transgenic labeling

S565.1

A

1002-6630（2015）04-0193-05

10.7506/spkx1002-6630-201504038

2014-03-12

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303083-2）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2014304）；南京市生物農(nóng)業(yè)項目（2013）

劉欣（1989—），女，碩士研究生，主要從事肉品加工與質(zhì)量控制研究。E-mail：liuxin_ld@sina.com

*通信作者：黃明（1970—），男，教授，博士，主要從事肉品加工與質(zhì)量控制研究。E-mail：mhuang@njau.edu.cn