梁敏慧，崔亞娟*，葉 潤，李 全霞，陳兆天，李菁菁，李 東

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069）

UPLC-IDMS法測定配方奶粉中的生物素含量

梁敏慧1，崔亞娟2,*，葉 潤2，李 全霞2，陳兆天2，李菁菁2，李 東2

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069）

建立一種超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測定配方奶粉中生物素含量的方法。樣品中加入生物素-D2作為同位素內(nèi)標(biāo)，經(jīng)水超聲提取后，以含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明：生物素在1～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性范圍內(nèi)對已知生物素含量樣品3 個標(biāo)準(zhǔn)添加水平的平均回收率為89.6%～93.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.71%～4.33%。方法檢出限為0.6 μg/100 g，定量限為1.5 μg/100 g，該方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、分析時間短等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足配方奶粉中生物素含量的測定要求。

生物素；超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜；奶粉

生物素又叫做VB7，是一種水溶性B族維生素。生物素是構(gòu)成羧化酶的重要輔酶[1]，參與人體內(nèi)脂肪、糖類和氨基酸的代謝[2]，對于維持機(jī)體正常生理功能有重要的作用。其長期攝入不足會導(dǎo)致免疫、代謝、基因表達(dá)方面的疾病[3-7]。配方奶粉是嬰幼兒除母乳外主要的營養(yǎng)來源，因此對其中生物素的檢測監(jiān)督是十分必要的。

目前，配方奶粉中生物素的測定方法主要是微生物法[8-10]。微生物法也是我國分析嬰幼兒食品和乳品中生物素的國標(biāo)分析方法，其檢測靈敏度高，但是實(shí)驗(yàn)周期長、重復(fù)性差，對實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境有比較嚴(yán)格的要求。其他常用于生物素檢測的分析方法還包括生物傳感器法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法[1,11-12]等。超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatographyisotope dilution mass spectrometry，UPLC-IDMS）技術(shù)是一種新型的儀器分析手段，它將色譜良好的分離能力與質(zhì)譜的高選擇性結(jié)合起來，具有靈敏性高、選擇性好、分析速度快并且分析結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，近年來在食品分析中得到了廣泛的應(yīng)用[13-14]。而同位素稀釋技術(shù)[15-16]通過加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記物，可有效消除基質(zhì)效應(yīng)及處理過程帶來的較大偏差，盡可能保證了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來，國內(nèi)已有報道利用高效液相色譜-質(zhì)譜法測定配方奶粉中的生物素[17-19]，但采用同位素稀釋法分析測定奶粉中生物素含量的方法尚未見報道。

本實(shí)驗(yàn)采用可以抵消樣品處理過程中損失的同位素稀釋質(zhì)譜法，同時結(jié)合UPLC-串聯(lián)質(zhì)譜良好的分離能力及高選擇性，對配方奶粉中的生物素進(jìn)行了定性和定量分析，建立一種結(jié)果準(zhǔn)確、分析速度快、樣品處理簡單的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

配方奶粉樣品（樣品A～E、a～e） 市購。

生物素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%） 美國Supelco公司；生物素-D2標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%） 美國Iso Sciences公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜純） 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；硫酸、鹽酸（均為分析純） 北京化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity＠UPLC-Xevo TQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；BS224S型分析天平德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

生物素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（100 μg/mL）：精確稱取生物素1.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解至10 mL，搖勻，密封、避光保存。生物素-D2標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（100 μg/mL）：稱取生物素-D21.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解至10 mL，搖勻，密封、避光保存。臨用前根據(jù)需要用水稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品處理條件的優(yōu)化

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)[20-21]和標(biāo)準(zhǔn)[22]選取奶粉經(jīng)0.5 mol/L硫酸、1.0 mol/L鹽酸溶解后在121 ℃，1 MPa條件下水解30 min和水溶解后超聲10 min作為樣品提取方法，考察不同提取方法的提取效果。并通過實(shí)驗(yàn)比較三氯甲烷、調(diào)pH值、乙腈和高氯酸去除蛋白質(zhì)的效果。

確定樣品處理方法后稱取奶粉樣品7 g（精確至0.000 1 g）于50 mL錐形瓶中，加入與樣品中生物素含量相近的生物素-D2標(biāo)準(zhǔn)儲備液；瓶中加入30 mL溫水振搖溶解后，超聲提取10 min。冷卻至室溫，用5 mol/L硫酸調(diào)pH值到1.7，再用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值到4.6，溶液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，用水沖洗3 次，合并溶液于容量瓶中，定容混勻后過濾，濾液過0.2 μm聚丙烯濾膜濾膜，待上機(jī)分析。

1.3.3 色譜條件優(yōu)化

色譜柱：實(shí)驗(yàn)比較BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Acquity＠HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分離效果的差異；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相A：含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B：乙腈。梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table1 Elution conditions of mobile phase

1.3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

電噴霧離子源正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓3 000 V；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣溫度500 ℃；去溶劑氣流速（氮?dú)猓? 000 L/h；碰撞氣流速（氬氣）0.18 mL/min。

在電噴霧源正離子檢測方式下，生物素的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+峰。配制0.5 μg/mL的生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)節(jié)各個參數(shù)得到響應(yīng)較強(qiáng)的[M+H]+母離子峰。然后對母離子進(jìn)行子離子掃描，調(diào)節(jié)碰撞能量，選擇響應(yīng)較高的2 個子離子作為定性定量離子。2 個離子中響應(yīng)高的作為定量離子，另一個作為定性離子。優(yōu)化確定適合本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜條件。

1.3.5 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 線性范圍

準(zhǔn)確吸取生物素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，添加與試樣中生物素含量相近的生物素同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用水配制成質(zhì)量濃度為1、5、10、20、30、40、50 ng/mL的生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，確定生物素的線性范圍。

1.3.5.2 檢出限與定量限

選擇木薯淀粉作為空白樣品（經(jīng)測定不含生物素），對其進(jìn)行不同水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，樣品進(jìn)行前處理后，以RSN為3和RSN為10作為生物素的檢出限和定量限。

1.3.5.3 精密度與回收率

向已知生物素含量的奶粉樣品中分別添加3 個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，各個添加水平平行測定6 次，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的精密度與回收率。

1.3.5.4 與微生物方法比對

選取5 種市購的配方奶粉（樣品A～E），每種樣品平均分成2 份，一份采用微生物法測定其中的生物素含量，另一份采用UPLC-IDMS測定其中的生物素含量，每份平行測定6 次，計算奶粉中生物素含量，通過2 種方法結(jié)果的比較驗(yàn)證UPLC-IDMS方法的可行性與準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

表2 不同前處理方法結(jié)果Table2 Comparison of different sample pretreatment procedures

不同提取方法的提取效果見表2。結(jié)果顯示，3 種方法最終測定值并無顯著差異，都可以獲得較好的結(jié)果。但用水超聲提取處理樣品后，儀器峰面積響應(yīng)值要比另外2 種方法高出很多，這可能是由于酸對生物素及其內(nèi)標(biāo)的離子抑制作用而導(dǎo)致了儀器響應(yīng)值的顯著降低?？紤]到分析的準(zhǔn)確性，選擇使用水超聲處理作為樣品的提取方法。

配方奶粉中含有大量的蛋白質(zhì)存在降低生物素的離子化效率風(fēng)險，從而影響分析的準(zhǔn)確性，并縮短色譜柱的使用壽命[18]。實(shí)驗(yàn)通過比較三氯甲烷、調(diào)pH值、乙腈和高氯酸去除蛋白質(zhì)的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯甲烷、調(diào)pH值以及高氯酸法沉淀蛋白效果較好，可以獲得較為澄清的溶液，回收率均為90%以上。但考慮到色譜柱適合的pH值范圍以及不同樣品在水中的pH值差異會影響生物素在色譜柱上的保留時間，因此選擇調(diào)pH值法作為去除蛋白質(zhì)的方法。

2.2 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中2 種色譜柱的分離效果差異見圖1。C18柱的保留時間比T3柱提前，2 種柱子對生物素都有良好的分離效果，但T3柱的響應(yīng)值（6.28×106）要好于C18柱（3.24×106）的響應(yīng)值，因此實(shí)驗(yàn)選擇T3柱。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件優(yōu)化后確定的生物素定性和定量離子對分別為m/z 245.1＞97.0和m/z 245.1＞227.0，生物素-D2的定性和定量離子對分別為m/z 247.1＞99.0和m/z 247.1＞229.0。生物素及其同位素的母離子、定量定性離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)見表3。生物素及其同位素-D2的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖2，子離子掃描圖見圖3。

表3 生物素及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table3 Instrumental parameters of biotin and biotin-D

圖2 生物素及生物素--DD2的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of biotin and biotin-D2

圖3 生物素和生物素--DD2的離子掃描質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of biotin and biotin-D2

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍

以生物素與生物素內(nèi)標(biāo)峰面積比（A生物素/A生物素-D2）和同位素質(zhì)量濃度的乘積為 縱坐標(biāo)，生物素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4所示。生物素在1～50 ng/mL范圍內(nèi)，線性回歸方程為Y=1.826 97X+ 0.049 075 6，相關(guān)系數(shù)r大于0.999 8，線性關(guān)系良好，十分適合做定量分析。

圖4 生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The calibration curve of biotin

2.4.2 檢出限與定量限

以RSN為3作為檢出限，RSN為10作為定量限，得到方法的檢出限為0.4 ng/mL，定量限為1.0 ng/mL。當(dāng)奶粉質(zhì)量為7 g，定容體積為100 mL時，折算成奶粉含量分別為0.6 μg/100 g和1.5 μg/100 g，表明該方法可對生物素含量較少的奶粉樣品進(jìn)行定性定量分析。

2.4.3 精密度與回收率

向奶粉樣品中分別添加3 個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，各個水平平行測定6次，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。生物素3 個水平的加標(biāo)回收率在89.6%～93.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.71%～4.33%，表明該方法比較準(zhǔn)確，適用于奶粉中生物素的定性定量分析。

表4 生物素加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of recovery and relative standard deviation

2.4.4 與微生物方法的比對

微生物法是我國測定嬰幼兒食品和乳品中生物素的國標(biāo)分析方法。實(shí)驗(yàn)比較了UPLC-IDMS法與微生物法之間的差異來驗(yàn)證所建立方法的準(zhǔn)確性。對5 種配方奶粉樣品同時做了2 種方法的比對實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果見表5。 利用SPSS軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果做非參數(shù)Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，分析2 種方法測定結(jié)果之間差異是否顯著：得出P值為0.705（P＞0.05），表明2 種方法測定結(jié)果無顯著差異，證明了實(shí)驗(yàn)建立的方法可以用于配方奶粉中生物素的檢測。

表5 微生物法和UPLC-IDMS法對照實(shí)驗(yàn)Table 5 Comparison of microbiological method and UPLC-IDMS method

2.5 實(shí)際樣品測定結(jié)果

表6 配方奶粉中生物素UPLC-IDMS測定結(jié)果Table 6 Analytical results for milk powder samples by UPLC-IDMS

利用所建立的方法對市售的5 種配方奶粉（樣品a～e）進(jìn)行測定，每個樣品平行測定3 次，計算平均值，結(jié)果見表6?？梢钥闯觯? 種配方奶粉中生物素含量均大于8 μg/100 g的，符合國家標(biāo)準(zhǔn)[23]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種可以快速檢測配方奶粉中的生物素含量的方法。奶粉中生物素含量較低且基質(zhì)復(fù)雜，通過加入同位素內(nèi)標(biāo)可消除實(shí)驗(yàn)過程中基質(zhì)效應(yīng)的影響和處理過程生物素?fù)p失帶來的偏差，同時利用質(zhì)譜的高選擇性，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，獲得了穩(wěn)定良好的測定結(jié)果。該方法操作過程簡單，分析周期短、靈敏度高、重復(fù)性好，適合奶粉中生物素的分析研究，必將受到廣泛的重視。

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Determination of Biotin in Milk Powder by Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Isotope Dilution Mass Spectrometry

LIANG Minhui1, CUI Yajuan2,*, YE Run2, LI Quanxia2, CHEN Zhaotian2, LI Jingjing2, LI Dong2
(1. College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 2. Beijing Research Institute for Nutritional Resources, Beijing 100069, China)

An ultra performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry (UPLC-IDMS) method has been developed for the determination of biotin in milk powder. After spiking biotin-D2as an internal standard, samples were extracted with water. The mobile phase consisted of 10 mmol/L ammonium acetate with 0.1% f ormic acid and acetonitrile. The biotin was identified under multiple-reaction monitoring (MRM) mode and quantified by an internal standard method. The results showed a good linear calibration in the range of 1–50 ng/mL, the recoveries at three spiked levels and the relative standard deviations were 89.6%–93.1% and 1.71%–4.33%, respectively. T he limit of detection and quantification for biotin were 0.6 μg/100 g and 1.5 μg/100 g, respectively. This method is sensitive, time saving, and accurate for the determination of biotin in milk powder.

biotin; ultra performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry (UPLC-IDMS); milk powder

TS207.3

A

1002-6630（2015）04-0136-05

10.7506/spkx1002-6630-201504026

2014-07-02

北京市科委科技新星計劃項目（2011059）；衛(wèi)生部行業(yè)科研專項（201202012）

梁敏慧（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称贩治?。E-mail：lmh29301126@163.com

*通信作者：崔亞娟（1979—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称贩治?。E-mail：cuiyj66@163.com