李 柰，龍立梅，樊 琛，李小波，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

黃蜀葵花中金絲桃苷及其異構(gòu)體的分離純化

李 柰，龍立梅，樊 琛，李小波，曹學(xué)麗*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

應(yīng)用聚酰胺柱層析法和高效制備液相色譜法研究黃蜀葵花（Abelmoschus manihot（L.） Medi cus）中金絲桃苷及其異構(gòu)體分離制備方法。結(jié)果表明：黃蜀葵花粗提物經(jīng)聚酰胺柱層析分離后，50%乙醇洗脫液中可得到金絲桃苷及其異構(gòu)體的混合物，將混合物凍干后經(jīng)高效制備液相色譜分離，高效制備液相柱為Calesil A-120（250 mm×21.2 mm，10 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%乙酸（15∶85，V/V），上樣量20.0 mg，流速25.0 mL/min，柱溫3 0 ℃，檢測波長280 nm，得到純度分布在99%和97%以上的兩種純物質(zhì)。經(jīng)核磁共振及質(zhì)譜分析，鑒定其分別為金絲桃苷和異槲皮苷，二者互為立體異構(gòu)體。

黃蜀葵花；聚酰胺柱層析；高效制備液相色譜；金絲桃苷；異槲皮苷

黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物蜀葵（Abelmoschus manihot（L.）Medicus）的干燥花朵，具有清利濕 熱、消腫解毒之功效[1]。其中的黃酮類活性成分如金絲桃苷、蘆丁、槲皮素等具有抗結(jié)腸癌[2]、保肝[3-4]、心腦血管保護(hù)[5-6]、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)[7-8]、抗氧化[9]等多種功能，因此受到人們越來越多的關(guān)注。金絲桃苷廣泛存在于各種植物體內(nèi)，但在藤黃科金絲桃屬植物貫葉連翹和錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵花中分布較多，其含量分別為1.02%和1.12%[10]。金絲桃苷通常與其眾多的結(jié)構(gòu)類似物并存[11-12]，給分離純化帶來了一定的困難。目前分離純化常采用的方法為大孔吸附樹脂[13-14]、正相硅膠、反相ODS、Sephadex LH-20等[15-19]反復(fù)的柱層析法，這些方法步驟復(fù)雜，且得率較低。聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類高分子化合物，是分離黃酮類物質(zhì)的理想吸附劑，其吸附強(qiáng)度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基的數(shù)目與位置，以及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小[20]。本研究將聚酰胺柱層析法與高效制備液相色譜法相結(jié)合，較簡便地分離得到高純度金絲桃苷及其立體 異構(gòu)體異槲皮苷。該 方法可為高純度金絲桃苷及異槲皮苷對照品的制 備及其進(jìn)一步藥理活性研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃蜀葵花粗提物 寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；層析聚酰胺（100～200 目） 西安樸天生物科技有限公司；無水乙醇（分析純） 北京化工廠；乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；冰乙酸（色譜純）天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；純水由Millipore-Q純水機(jī)自制。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ALPHA1-4LSC型真空冷凍干燥機(jī) 博勱行儀器有限公司；1100型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)（配有可變波長紫外檢測器和Rev.A.06.03色譜工作站） 美國Agilent公司；聚酰胺柱層析系統(tǒng)（玻璃層析柱φ3.5 cm×70 cm，BSZ-4型自動(dòng)部分收集器） 上海滬西分析儀器廠；DHL-A型電腦恒流泵 北京圣益通技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司；三重四極桿5500TM液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國AB Sciex公司；AV 600超導(dǎo)核磁共振波譜儀 瑞士Bruker公司；Sprot Prep制備系統(tǒng)（配有V2梯度泵、可變波長檢測器） 法國Armen公司；Calesil A-120色譜柱（250 mm×21.2 mm，10 μm；250mm×10 mm，10 μm） 上海Sunyear科技公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC色譜分析條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；上樣量：10 μL；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈（A），0.2%乙酸（B）；梯度洗脫：0～10.0 min，15%A；10.0～15.0 min，15%～50%A；15.0～20.0 min，50%～70%A；20.0～25.0 min，70%～90%A；25.0～30.0 min，90%～100%A；30.0～40.0 min，100%A。

1.3.2 聚酰胺柱層析法分離

稱取100.0 g層析用聚酰胺，加入1 000 mL無水乙醇浸泡24 h，然后用去離子水洗滌至無醇味。采用濕法裝入層析柱（φ3.5 cm×70 cm，柱體積1 BV為450 mL），待柱平衡后以黃蜀葵花粗提物為樣品上樣，上樣量為5.0 g。隨后用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇進(jìn)行梯度洗脫，分別為30%乙醇洗脫1 BV、50%乙醇洗脫3 BV、70%乙醇洗脫1 BV、90%乙醇洗脫3 BV。洗脫流速為5.0 mL/min，每5 min收集1 管。將洗脫級分用HPLC分析，繪制黃蜀葵花中金絲桃苷及其異構(gòu)體的洗脫曲線圖，合并收集目標(biāo)級分，濃縮凍干，以備下一步分離使用。

1.3.3 高效制備液相色譜法分離

首先采用小型高效制備液相柱（250 mm×10 mm，10 μm）對聚酰胺分離出的目標(biāo)混合物進(jìn)行洗脫條件的探索?；旌衔锏纳蠘恿繛?.0 mg，流速5.0 mL/min，洗脫40 min。洗脫體系為乙腈-0.2%乙酸（分別為10∶90、15∶85、20∶80，V/V）。

選取最適的高效制備液相色譜分離方法，采用大型高效制備液相柱（250 mm×21.2 mm，10 μm）進(jìn)行分離，上樣量為20.0 mg，洗脫體系為乙腈-0.2%乙酸（15∶85，V/V），對洗脫流速進(jìn)行選擇，分別為：20.0 mL/min和25.0 mL/min，然后選擇一個(gè)最適流速進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃蜀葵花粗提物的HPLC分析

圖1 黃蜀葵花粗提物及金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of crude extract of Abelmoschus manihot (L.) Medicus and hyperoside standard

由圖1可知，黃蜀葵花粗提物中1號物質(zhì)為金絲桃苷，出峰時(shí)間為10.173 min，成分2物質(zhì)的出峰時(shí)間為11.017 min，且其紫外光譜圖均顯示了黃酮特征。

2.2 聚酰胺柱層析分離黃蜀葵花粗提物

黃蜀葵花粗提物經(jīng)聚酰胺柱層析后，各洗脫級分經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷與另外一個(gè)成分2（圖1）共同被50%乙醇洗脫出來，且?guī)缀鯖]有分離趨勢，其洗脫曲線如圖2所示。表明它們的結(jié)構(gòu)類似，具有一定的分離難度。合并收集此部分的級分，冷凍干燥后待進(jìn)一步分離。

圖2 金絲桃苷及其異構(gòu)體的聚酰胺柱洗脫曲線Fig.2 Polyamide chromatography elution curve of hyperoside and its isomer

2.3 高效制備液相色譜分離金絲桃苷異構(gòu)體

采用小型高效制備液相柱（250 mm×10 mm，10 μm），用不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，波長280 nm，柱溫30 ℃，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同流動(dòng)相比例的小型高效制備液相色譜圖Fig.3 Preparative HPLC profiles with different mobile phase proportions

通過不同的流動(dòng)相比例發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗脫體系乙腈-0.2%乙酸體積比10∶90時(shí)，40 min內(nèi)2 個(gè)混合物不能被洗脫出來，所以需適當(dāng)增加乙腈的比例。但當(dāng)洗脫體系乙腈-0.2%乙酸體積比20∶80時(shí)，金絲桃苷及其異構(gòu)體被一同洗脫出來，所以最適合的流動(dòng)相比例為乙腈-0.2%乙酸體積比15∶85。

在大型高效制備液相柱（250 mm×21.2 mm， 10 μm）中考察了流動(dòng)相流速對分離效果的影響，流速分別為20.0、25.0 mL/min，上樣量20.0 mg，體系為乙腈-0.2%乙酸體積比15∶85，波長280 nm，柱溫30 ℃，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同流速的大型高效制備液相色譜圖Fig.4 Preparative HPLC profiles with different flow rates

當(dāng)流速為20.0 mL/min時(shí)，金絲桃苷及其異構(gòu)體可以實(shí)現(xiàn)基線分離，但存在洗脫時(shí)間過久，峰形較寬的問題，所以適當(dāng)提高洗脫流速。當(dāng)流速為25.0 mL/min時(shí)，金絲桃苷的出峰時(shí)間提前了10 min，且得到了比較滿意的分離效果，所以采用該洗脫體系及流速進(jìn)行連續(xù)上樣，分離制備兩個(gè)成分，每隔5 min進(jìn)樣1 次，圖5為連續(xù)2 次上樣的制備色譜圖。

圖5 金絲桃苷及其異構(gòu)體混合物的連續(xù)進(jìn)樣制備分離色譜圖Fig.5 Preparative HPLC profile with continuous injection

經(jīng)過高效制備液相色譜可以將成分1、2完全分離，將分離物收集濃縮干燥后，采用HPLC分析，結(jié)果如圖6所示。成分1（金絲桃苷）的純度可達(dá)99.2%，成分2的純度可達(dá)到97.7%。最后采用核磁共振及質(zhì)譜對2種物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

圖6 混合物及分離后兩物質(zhì)的HPLLCC圖Fig.6 HPLC chromatograms of mixture and individuals of two isomers

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

將純化后的成分1、2進(jìn)行紅外吸收光譜、核磁共振及質(zhì)譜鑒定。成分1 紅外吸收光譜：3 306 cm—1寬峰是羥基伸縮振動(dòng)峰、1 656 cm—1是羰基伸縮振動(dòng)峰、1 606 cm—1和1 504 cm—1是苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)峰、1 087 cm—1是苷鍵伸縮振動(dòng)峰（圖7A）。

C21H20O12，電噴霧電離質(zhì)譜m/z：465.4 [M+H]+；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：12.62（1H，s，5-OH）、6.18（1H，d，J=1.2 Hz，H-6）、6.38（1H，d，J=1.2 Hz，H-8）、7.53（1 H，d，J=1.8 Hz，H-2’）、6.81（1H，d，J=7.8 Hz，H-5’）、7.66（1H，dd，J=1.8、7.8 Hz，H-6’）、5.38（1H，d，J=7.2 Hz，H-1”）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ∶ 156.55（C-2）、133.88（C-3）、177.78 （C-4）、161.65（C-5）、102.37（C-6）、165.52 （C-7）、94.08（C-8）、156.84（C-9）、104.03（C-10）、121.47 （C-1’）、115.64 （C-2’）、145.35（C-3’）、149.08（C-4’）、116.33 （C-5’）、122.42（C-6’）、99.39 （C-1”）、76.29（C-2”）、73.68 （C-3”）、71.68（C-4”）、68.37（C-5”）、60.58（C-6”）。該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21-23]一致，確定成分1為金絲桃苷。

成分2 紅外吸收光譜：3 214 cm—1寬峰是羥基伸縮振動(dòng)峰、1 655 cm—1是羰基伸縮振動(dòng)峰、1 604 cm—1和1 509 cm—1是苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)峰（圖7B）。

C21H20O12，電噴霧電離質(zhì)譜m/z：465.4 [M+H]+；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：12.63 （1H，s，5-OH）、 6.17（1H，d，J=1.2 Hz，H-6）、6.37（1H，d，J=1.2 Hz，H-8）、7.59（1H，d，J=1.2 Hz，H-2’）、6.83（1H，d，J=7.8 Hz，H-5’）、7.58（1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-6’）、5.47 （1H，d，J=7.2 Hz，H-1”）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ∶ 156.91（C-2）、133.73（C-3）、177.78（C-4）、161.52（C-5）、99.64（C-6）、164.71（C-7）、94.01（C-8）、1 5 6.5 4（C-9）、1 0 4.1 2 （C-1 0）、1 2 2.0 2（C-1’）、1 1 5.6 4（C-2’）、145.33 （C-3’）、149.15（C-4’）、116.61 （C-5’）、121.58（C-6’）、101.42（C-1”）、74.52（C-2”）、76.91（C-3”）、70.11（C-4”）、78.02（C-5”）、61.43（C-6”）。該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24-26]一致，確定成分2為異槲皮苷。

圖7 紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra of hyperin and isoquercitrin

兩種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖8所示。其結(jié)構(gòu)上的差異僅在3位糖苷連接鍵的立體位置，二者屬于立體異構(gòu)體。

圖8 金絲桃苷與異槲皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.8 Chemical structures of hyperoside and isoquercitrin

3 結(jié) 論

本研究采用聚酰胺柱層析分離黃蜀葵花粗提物，從部分50%乙醇洗脫液中得到金絲桃苷與異槲皮苷的混合物，而且兩種物質(zhì)幾乎沒有分離趨勢。將混合樣品凍干后采用高效制備液相進(jìn)行進(jìn)一步的分離，在小型高效制備液相柱中考察了流動(dòng)相比例對分離效果的影響，在大型高效制備液相柱中考察了流速的影響，選擇最優(yōu)的分離條件為：選用Calesil A-120色譜柱（250 mm×21.2 mm，10 μm），上樣量20.0 mg，流速25.0 mL/min，洗脫體系為乙腈-0.2%乙酸（15∶85，V/V），波長280 nm，柱溫30℃，可連續(xù)上樣，并取得了較好的分離效果。經(jīng)HPLC分析，金絲桃苷的純度可達(dá)99.2%，異槲皮苷的純度可達(dá)到97.7%，本研究為兩種立體異構(gòu)體的分離提供了一定的方法參考。

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Separation of Hyperoside and Its Isomers from Abelmoschus manihot (L.) Medicus Flowers

LI Nai, LONG Limei, FAN Chen, LI Xiaobo, CAO Xueli*
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Polyamide chromatography and preparative high performance liquid chromatography (HPLC) were used for the separation and preparation of two isomers of hyperoside from Abelmoschus manihot (L.) Medicus flowers. The results indicated that the 50% ethanol eluate contained a mixture of hyperoside and its isomers after polyam ide chromatography. Then the freeze-dried mixture was separated by preparative HPLC on Calesil A-120 column (250 mm × 21.2 mm , 10 μm) with a cetonitrile-0.2% aqueous acetic acid (15:85, V/V) as the mobile phase by injecting 20.0 mg of the sample at a flow rate of 25.0 mL/ min; the column temperature was 30 ℃, and detection wavelength was 280 nm. Two isomers were achieved and identified by MS,1H and13C NMR as hyperoside and isoquercitrin with purities of more than 99% and 97%, respectively, and both were stereoisomer.

Abelmoschus manihot (L.) Medicus; polyamide chromatography; preparative high performance liquid chromatography; hyperoside; isoquercitrin

R284

A

1002-6630（2015）04-0131-05

10.7506/spk x1002-6630-201504025

2014-06-26

北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ201410011016）

李柰（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程。E-mail：linai1989@126.com

*通信作者：曹學(xué)麗（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锓蛛x技術(shù)。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn