田木星，王偉華*，涂 玲

（塔里木大學生命科學學院，新疆生產(chǎn)建設兵團南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

響應面分析法優(yōu)化超聲波提取干制紅棗中大位阻農(nóng)藥三唑錫工藝

田木星，王偉華*，涂 玲

（塔里木大學生命科學學院，新疆生產(chǎn)建設兵團南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

以干制紅棗為材料，研究超聲波輔助法提取大位阻農(nóng)藥三唑錫的最佳條件?？疾斐曁崛」β?、提取溫度、提取時間、料液比及提取次數(shù)5 個單因素對三唑錫提取的影響，并在單因素試驗的基礎上進行響應面分析，得到三唑錫提取的最佳工藝條件為溫度45 ℃、頻率45 kHz、料液比1∶12（g/mL）、提取6次、提取時間50 min、超聲提取功率70 W，經(jīng)驗證，此條件下三唑錫含量為0.15 mg/kg。

超聲提?。患t棗；三唑錫

新疆因地域遼闊，光熱資源豐富，發(fā)展特色林果有得天獨厚的自然優(yōu)勢，素有“瓜果之鄉(xiāng)”的美譽。新疆已形成了南疆環(huán)塔里木盆地以紅棗、香梨、蘋果等 為主的特色林果主產(chǎn)區(qū)，果品總產(chǎn)量超過530萬 t。尤其是紅棗的發(fā)展無論從種植面積還是從產(chǎn)量、品質(zhì)上，都將河南、河北等紅棗傳統(tǒng)產(chǎn)地甩在了后頭。年產(chǎn)值可達150億 元，為新疆經(jīng)濟的騰飛做出了卓越的貢獻[1-2]。在巨大經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，食品安全隱患依然存在，不容忽視。在種植棗業(yè)上，超范圍使用農(nóng)藥及非法使用化學品的現(xiàn)象仍較為嚴重，通過調(diào)研了解到，南疆紅棗中目前使用的農(nóng)藥多數(shù)是針對蟲害（螨蟲、紅蜘蛛、棗癭蚊等）的，例如：噠螨靈、三唑錫及螨危等，這些農(nóng)藥使用范圍廣、降解速度慢、殘留時間長，嚴重威脅人們健康[3]。

圖1 三唑錫結構Fig.1 Structure of azocyclotin

三唑錫是一種有機錫類的高效、廣譜、觸殺性殺螨劑，結構見圖1，其化學名稱為三（環(huán)己基）-1H-1,2,4-三唑-1-基錫[4-6]。國際食品法典委員會規(guī)定三唑錫的最高殘留限量為0.1 mg/kg，GB 2763—2005《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定水果中的最高殘留限量為2.0 mg/kg，法國規(guī)定為0.20 mg/kg，國際食品法典委員會規(guī)定為0.1 mg/kg，日本2006年開始實施的“肯定列表制度”規(guī)定所有食品中均不得檢出三唑錫[7-12]。

三唑錫具有亞急性和慢性毒性、致敏性、致突變性、致畸性及致癌性。三唑錫對環(huán)境危害較大，攝入或與皮膚接觸可引起中毒[13-14]。

本實驗以紅棗中使用面廣且危害較大的農(nóng)藥三唑錫為研究對象，考察提取時間、提取溫度、提取次數(shù)、超聲提取功率及料液比5 個單因素對其提取工藝的影響，采用響應面法[15-16]，建立回歸分析模型，從而確立三唑錫的最佳提取條件，為建立該農(nóng)藥快速檢測方法提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗去核切碎之后于60 ℃恒溫干燥，待用。

甲醇、正丁醇、丙酮、氯仿、乙腈等均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-100VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PL2002電子分析天平 梅特勒-托利多集團；GZX-9246MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 標準液配制

準確稱取三唑錫標準品0.10 g，用甲醇溶解并定容于50 mL的容量瓶中，搖勻，得到0.2%的母液，用雙光束紫外-可見分光光度計在190～400 nm波長處進行掃描從而確定三唑錫的最大吸收波長。

1.3.2 標準曲線的測定

先將上述溶液稀釋100 倍后，分別取三唑錫標準液0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL于10 mL容量瓶中用甲醇稀釋，用雙光束紫外-可見分光光度計在213 nm波長處測定吸光度。

1.3.3 提取溶劑的選取

分別稱取已處理好的干制紅棗2.00 g，在超聲提取溫度45 ℃、時間30 min、功率70 W、料液比1∶6，提取次數(shù)3 次的條件下分別用甲醇、正丁醇、丙酮、氯仿及乙腈進行提取。測定吸光度確定最佳提取溶劑。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 提取次數(shù)對超聲波提取的影響

稱取2.00 g處理好的樣品于三角瓶中，在溫度50 ℃、時間30 min、頻率45 kHz、功率70 W的條件下進行提取，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6，在3 000 r/min條件下離心20 min，取上清液定容至50 mL，在分光光度計上測其吸光度。

1.3.4.2 提取時間對超聲波提取的影響

提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min。稱取2.00 g處理好的樣品于三角瓶中，按料液比1∶6加入甲醇，溫度45 ℃、頻率45 kHz、提取功率70 W、提取次數(shù)6 次的條件下進行超聲提取，在3 000 r/min條件下離心20 min，取上清液定容至50 mL，測量吸光度。

1.3.4.3 提取溫度對超聲波提取的影響

提取溫度分別為25、35、45、55、65 ℃條件下進行提取。稱取2.00 g處理好的樣品于三角瓶中，按料液比1∶6加入甲醇、時間50 min、頻率45 kHz、功率70 W，在超聲儀上進行提取，在3 000 r/min條件下離心20 min，取上清液定容至50 mL，在分光光度計上測其吸光度。

1.3.4.4 提取功率對超聲波提取的影響

將提取功率設為50、60、70、80、100 W的條件下提取。具體操作方法為：稱取2.00 g處理好的樣品于三角瓶中，按料液比1∶6加入甲醇，時間50 min、頻率45 kHz、提取溫度45 ℃在超聲提取器上進行提取，在3 000 r/min條件下離心20 min，取上清液定容至50 mL，在213 nm波長處測其吸光度。

1.3.4.5 提取料液比對超聲波提取的影響

將料液比設為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的條件下進行提?。醇尤爰状嫉牧繛?2、16、20、24 mL、28 mL）。稱取2.00 g處理好的樣品于三角瓶中，設置超聲提取器時間50 min、頻率45 kHz、提取溫度45 ℃、功率70 W條件下進行提取。在3 000 r/min條件下離心20 min，取上清液定容至50 mL，在213 nm波長處測其吸光度。

1.3.5 響應面法的設計

根據(jù)SAS9.0中Box-Behnken試驗設計原理[17]，根據(jù)前期試驗選擇3 個篩選的關鍵因素功率、時間、料液比為研究對象，以紅棗中提取的三唑錫的吸光度為響應值，進行了三因素三水平的二次響應面回歸試驗[18-20]（表1）。

表1 響應面分析的因素與水平Table1 Factors and levels used for response surface analysis

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的測定

圖2 三唑錫的吸收波長Fig.2 Absorption wavelength of azocyclotin

由圖2可知，三唑錫的最大吸收波長為213 nm。

2.2 標準曲線的測定

將配制好的溶液按進行檢測，得到標準曲線為y=0.025 5X+0.002 4（R2=0.997）。

2.3 提取溶劑的選取

將超聲提取液進行過濾，取上清液1 mL稀釋至25 mL，于213 nm波長處測其吸光度。由表2可知，對三唑錫提取最好的有機溶劑為甲醇，故后期實驗中選用甲醇作為三唑錫的提取溶劑。

表2 提取溶劑的影響Table2 Effect of extraction solvent type on the extraction rate of azocyclotin

2.4 單因素試驗

圖3 不同因素對三唑錫提取的影響Fig.3 Effects of different factors on the extraction rate of azocyclotin

由圖3a可知，提取次數(shù)越多提取的總量越大，但也不是無限增大，當提取近乎完全時，無需再增加提取次數(shù)。實驗證明提取5 次和6 次最高，且二者之間沒有顯著差異。提取次數(shù)到達5～6 次時，提取量增加不明顯，因此可以把第6次提取出的質(zhì)量看作2.00 g棗中的三唑錫的總質(zhì)量，故根據(jù)標準曲線公式可以得出2.00 g中總的三唑錫的量為0.3 mg。

由圖3b可知，提取時間越長，所提取的三唑錫的量就越高，且變化較平緩。結果表明，一次的提取時間為50 min和60 min時是最佳水平，且二者之間無顯著差異。故為了節(jié)省能耗，選擇50 min作為提取時間。

由圖3c可知，45 ℃條件下提取的三唑錫是最多的，這可能是由于高溫有利于提取，但也不是隨著溫度的升高而增大的。因為溫度越高甲醇越容易揮發(fā)，因此選用45 ℃進行提取。

由圖3d可知，功率大于70 W的各處理的三唑錫提取量無顯著差異，這說明并不是功率越大越好，當功率達到一定值時，有可能影響到三唑錫的結構和形狀，故而提取出的三唑錫的量有所下降。

由圖3e可知，提取溶劑比例越大，達到飽和時能提取的三唑錫也越多。因此，隨著提取溶劑增加，所提取的三唑錫也是逐漸增加的。結果表明料液比1∶12和1∶14是最好的水平，兩者間無顯著差異。但是從節(jié)省溶劑考慮，可以選取料液比為1∶12。

2.5 響應面試驗結果

在單因素試驗結果上，以X1、X2、X3為自變量，以三唑錫的吸光度為響應值，進行響應面分析試驗，結果見表3。

表3 響應面試驗分析方案及結果Table3 Program and experimental results for response surface analysis

表3中試驗1～12為析因試驗，13～15為中心試驗。15 個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復3 次，用以估計試驗誤差。采用SAS RSREG程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進行方差分析，分析結果見表4，3 個因素經(jīng)過擬合得到如下方程：

Y=0.76—1.995X1+0.059X2+15.962X3—0.040X1X2+ 7.981X1X3—0.041X2X3+0.021X12—0.086X22—0.063X32

表4 響應面方差分析結果Table4 ANOVA analysis of response surface model

從表4中SAS RSREG回歸分析結果可以知道，方程回歸顯著。由表4中的P值可知，X2、X22對Y值的影響顯著，表明試驗因素對響應值不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大的關系，交互作用的影響相對較小。這和模型回歸中的線性和二次項影響顯著相對應。

2.6 雙因素交互作用分析

按回歸方程分析進行軟件編程計算，得到了交互因素的響應面和等高線圖，從而得出2 個影響因素交互作用與響應值之間的關系，從表4和圖4可知，其交互作用效應均顯著。而料液比與提取時間的作用最為明顯。最優(yōu)點接近于提取功率70 W、提取時間50 min、料液比1∶12這3 個最優(yōu)工藝參數(shù)，經(jīng)驗證，此條件下三唑錫的含量為0.15 mg/kg。

圖4 雙因素作用的響應面與等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of factors on the extraction rate of azocyclotin

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，將響應面法應用于優(yōu)化紅棗中三唑錫的提取。結果表明，提取時間的一次項和二次項對三唑錫提取率的影響顯著。說明提取功率、提取時間和料液比對三唑錫提取率的影響不是簡單的線性關系?；貧w分析和驗證實驗結果表明，此方法合理可行。得到三唑錫提取的最佳條件為料液比1∶12（g/mL）、提取時間50 min、功率70 W，此條件下測得干制紅棗中三唑錫的含量為0.15 mg/kg。

[1] 姜闖. 南疆紅棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展中存在的問題及對策[J]. 山西果樹, 2012(2): 43-45.

[2] 姜羽晗, 王志彬. 新疆南疆紅棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問題及對策: 以阿克蘇為例[J]. 新疆農(nóng)墾科技, 2012(12): 36-38.

[3] 薛維家, 梁孝生, 孔斌. 三唑錫的液相色譜分析方法[J]. 農(nóng)藥科學與管理, 2001, 22(3): 17; 23.

[4] 高金勝, 馬東升, 王玉杰, 等. 三唑錫的晶體結構[J]. 黑龍江大學自然科學學報, 2001, 18(1): 75-77.

[5] 葉紀明. 新農(nóng)藥介紹[J]. 農(nóng)藥科學與管理, 2007, 28(6): 59.

[6] KUANG Daizhi, JIANG Jiangping, FENG Yonglan, et al. Synthesis and crystal structure of tetra (o-cyanobenzyl) tin[J]. Chinese Journal of Structure Chemistry, 2008, 27(1): 35-38.

[7] 林磊. 浙江省西蘭花應對日本“肯定列表”研究[D]. 天津: 河北工業(yè)大學, 2007.

[8] 國家質(zhì)檢總局和中國檢驗檢疫科學研究院. 日本厚生勞動省食品中農(nóng)用化學品殘留檢測方法[M]. 北京: 中國標準出版社, 2006.

[9] CAMPILLO N, VI?AS P, PE?ALVER R, et al. Solid-phase microextraction followed by gas chromatography for the speciation of organotin compounds in honey and wine samples: a comparison of atomic emission and mass spectrometry detectors[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2012, 25(1): 66-73.

[10] 王蕊. 食品中重金屬及有機錫農(nóng)藥殘留分析方法的研究[D]. 南昌:南昌大學, 2011.

[11] 張彩菁, 趙華. 三唑錫在柑桔上的殘留動態(tài)研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護, 1999, 18(2): 65-67; 72.

[12] 高偉平, 胡新功, 孫書軍, 等. 紅外光譜法測定三唑錫中三環(huán)錫[J].光譜實驗室, 2006, 23(6): 1143-1146.

[13] 田廣茹. 一種三唑三甲基錫衍生物的合成和結構研究[J]. 濟寧學院學報, 2012, 33(6): 30-34.

[14] 張一宗. 當今世界農(nóng)藥市場的特點及趨勢[J]. 新農(nóng)藥, 2006, 10(2): 1-4.

[15] 劉軍海, 黃寶旭, 蔣德超. 響應面分析法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝研究[J]. 食品科學, 2009, 30(2): 114-118.

[16] 陳健, 孫愛東, 高雪娟, 等. 響應面分析法優(yōu)化超聲波提取檳榔原花青素工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(4): 82-86.

[17] 王欽德, 楊堅. 食品實驗設計與統(tǒng)計分析[M]. 2版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2010.

[18] 慕運動. 響應面方法及其在食品工業(yè)中的應用[J]. 鄭州工程學院學報, 2001, 22(3): 91-94.

[19] 盧時勇, 錢俊青, 鄒小明. 響應面法優(yōu)化超聲提取白術有效成分的研究[J]. 中國中藥雜志, 2006(7): 549-552.

[20] 黃璞, 謝明勇, 聶少平. 響應曲面法優(yōu)化微波輔助提取黑靈芝孢子多糖工藝研究[J]. 食品科學, 2007, 28(10): 200-203.

Optimization of Ultrasonic-assisted Solvent Extraction Process for Azocyclotin from Dried Jujube by Response Surface Analysis

TIAN Muxing, WANG Weihua*, TU Ling
(Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Deep Processing of Agricultural Products in South Xinjiang, College of Life Science, Tarim University, Alar 843300, China)

The present work was undertaken to investigate optimal conditions for ultrasonic-assisted extraction azocyclotin from dried jujube. The effects of five factors including ultrasonic power, extraction temperature, extraction time, solid-toliquid ratio and extraction number on extraction efficiency were explored using a combination of single factor method and response surface methodology. An extraction temperature of 45 ℃, an ultrasonic frequency of 45 kHz, an ultrasonic power of 70 W and 50 min extractions performed six times with a solid-to-liquid ratio of 1:12 (g/mL) were selected as the optimal extraction conditions. Experiments conducted under these conditions resulted in an extraction rate of 0.15 mg/kg.

ultrasonic-assisted extraction; jujube; azocyclotin

TS207.7

A

1002-6630（2015）04-0058-05

10.7506/spkx1002-6630-201504011

2013-11-10

新疆生產(chǎn)建設兵團博士資金項目（2012BB012）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（2013107570010）

田木星（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量安全。E-mail：937828978@qq.com

*通信作者：王偉華（1977—），女，副教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量安全。E-mail：wangweihua6688@163.com