王玉昌，龐偉，馮歡歡，劉師振，張慧

痙攣型癱瘓大鼠骨骼肌DNA甲基化水平與肌纖維構(gòu)型①

王玉昌1，龐偉1，馮歡歡1，劉師振2，張慧3

目的探討骨骼肌在痙攣狀態(tài)下對DNA甲基化水平的影響及與肌纖維構(gòu)型的相關(guān)性。方法健康5日齡Wistar新生仔鼠100只，隨機分為模型組和對照組。前者制備痙攣型癱瘓大鼠模型成功后飼養(yǎng)30 d。對兩組大鼠腓腸肌進行肌肉活檢。分別進行骨骼肌DNA甲基化水平測定、骨骼?、裥图∏虻鞍字劓渕RNA半定量RT-PCR檢測，透射電鏡觀察。結(jié)果模型組骨骼肌總體DNA甲基化水平(4.95±0.83)×10%，顯著低于對照組的(6.59±0.75)×10%(P＜0.001)；模型組骨骼?、裥图∏虻鞍字劓渕RNA表達量(1.23±0.31)，顯著高于對照組的(0.44±0.29)(P＜0.001)。電鏡觀察，模型組骨骼肌Z線排列不規(guī)整，兩旁骨骼肌線粒體增多，線粒體腫脹，線粒體嵴部分?jǐn)嗔眩淮旨毤〗z數(shù)量關(guān)系失衡，肌原纖維包膜融合，有的包膜間隙增寬。結(jié)論痙攣型癱瘓大鼠骨骼肌DNA低甲基化，Ⅰ型肌球蛋白重鏈mRNA高表達；電鏡檢測以Ⅰ型纖維表現(xiàn)為主。沒有充足證據(jù)表明骨骼肌DNA甲基化水平與肌纖維構(gòu)型改變相關(guān)。

痙攣型癱瘓；甲基化；超微結(jié)構(gòu)；Ⅰ型肌球蛋白重鏈

[本文著錄格式]王玉昌，龐偉，馮歡歡，等.痙攣型癱瘓大鼠骨骼肌DNA甲基化水平與肌纖維構(gòu)型[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2015,21(5):519-523.

CITED AS:Wang YC,Pang W,Feng HH,et al.DNA methylation and muscle fiber configuration on skeletal muscle in spastic paralysis rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(5):519-523.

痙攣型癱瘓是腦性癱瘓中發(fā)病率最高的一種類型，預(yù)后相對較好，發(fā)病率約占腦癱的60%～70%[1]。康復(fù)過程中，肢體功能恢復(fù)時程較長，肌力增加幅度較慢。究其原因，除了上運動神經(jīng)元損傷外，骨骼肌特性的改變也會起重要作用。近年來，國外學(xué)者開展相關(guān)的組織化學(xué)研究，揭示痙攣型骨骼肌纖維組成以Ⅰ型纖維為主[2]；對于痙攣肌肉形態(tài)改變的分子機制缺乏報道[3-4]。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)修飾之一[5]，能在不影響基因結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，調(diào)控基因的表達，從而影響組織的表型。本研究探討痙攣狀態(tài)對

肌肉DNA甲基化水平及肌纖維超亞微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級5日齡Wistar大鼠100只，體重(21.10± 1.25)g，由吉林長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動物許可證號SCXK(吉)-2011-0004。室溫21～26℃、相對濕度43%～45%環(huán)境下飼養(yǎng)。

大鼠按體重編號，運用隨機數(shù)字表，抽出50個數(shù)字為模型組，其他為對照組。

1.2 器材與藥品

戊二醛：FLUKA CHEMIKA。RNA提取試劑盒：北京鼎國生物工程公司。ABI Prism 7000型定量PCR：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。HITACHI H-7650型透射電子顯微鏡：SONY。生理鹽水：哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號130131A52。水合氯醛：天津市百世化工有限公司，批號20140513，用生理鹽水配制成10%溶液。

1.3 方法

1.3.1 模型制備

模型組采用兩血管阻斷法[6]及雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制作痙攣型癱瘓模型。對照組只行頸總動脈剝離、探查術(shù)。

1.3.2 模型檢測

模型制備過程中死亡10只，術(shù)后24 h死亡6只；對照組麻醉過程中死亡4只。連續(xù)觀察48 h，模型組存活34只，對照組存活46只。術(shù)后30 d，模型組采用懸吊試驗和改良Ashworth評定表進行評定，大鼠下肢穩(wěn)定性差，四肢很少有隨意活動，跛行，下肢肌張力1級以上視為合格。

大鼠30日齡后，其行為、肌張力已與成年大鼠沒有明顯差異，神經(jīng)行為學(xué)特征性表現(xiàn)能充分展示，相當(dāng)于人類痙攣型癱瘓典型臨床癥狀表現(xiàn)階段[7]。

術(shù)后30 d，取模型組和對照組腓腸肌活檢。分為3份。

1.3.3 DNA甲基化水平檢測

腓腸肌組織用Agilent LC 1100型高效液相色譜儀進行總甲基化檢測。

總甲基化水平=5 mC的峰面積/(c的峰面積+5 mC的峰面積)×100%

1.3.4 RT-PCR檢測

腓腸肌組織行RNA提純及DNase檢測。采用Thermoscript PT-PCR系統(tǒng)和ABI.PRISM7000sequence導(dǎo)向系統(tǒng)進行mRNA的RT-PCR的熱循環(huán)。參照大鼠骨骼?、裥图∏虻鞍字劓?myosin heavy chain-I, MHC-Ⅰ)合成引物：

按照標(biāo)準(zhǔn)擴增30次。

原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換采用standard dilutions Linkeg軟件進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。

1.3.5 透射電鏡觀察

腓腸肌組織修成1×1×1 mm，2.5%戊二醛固定，隨機編號，送兩個電鏡實驗室觀察。1%四氧化鋨二次固定，乙醇逐級脫水，4號膠囊包埋，醋酸鈾和檸檬酸鉛依次染色，H-7650型透射電子顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

對總體甲基化水平數(shù)據(jù)由十位數(shù)轉(zhuǎn)換為個位數(shù)。數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理。甲基化水平與半定量RT-PCR數(shù)據(jù)用(ˉ±s)表示，采用獨立樣本t檢驗。甲基化水平與MHC-ⅠmRNA表達量進行Pearson相關(guān)性分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DNA甲基化水平和MHC-ⅠmRNA表達量

模型組骨骼肌DNA甲基化水平顯著低于對照組(P＜0.001)，MHC-ⅠmRNA顯著高于對照組(P＜0.001)。見表1。

表1 兩組骨骼肌DNA甲基化水平和MHC-ⅠmRNA的比較

模型組骨骼肌DNA甲基化水平和MHC-ⅠmRNA表達量呈弱負(fù)相關(guān)(r=-0.09,P＜0.001)，對照組DNA甲基化水平和MHC-ⅠmRNA表達量呈弱負(fù)相關(guān)(r=-1.18,P=0.01)。

2.2 電鏡觀察

骨骼肌纖維縱切面上，對照組肌原纖維由上千條粗、細兩種肌絲有規(guī)律地平行排列組成，Z線完整，線粒體規(guī)律排列在Z線兩旁，明、暗帶規(guī)律排列。橫切面可見粗細肌絲呈點狀規(guī)律分布，一條粗肌絲周圍有6條細肌絲；一條細肌絲周圍有3條粗肌絲(圖1)。

模型組可見線粒體排列在Z線之間數(shù)量多，線粒體結(jié)構(gòu)不完整，且集合分布于肌膜下；可見脂滴、肌漿膜間隙增寬、肌漿膜模糊不清。對線粒體放大后可

見其大小不一，部分腫脹，部分萎縮，嵴部分?jǐn)嗔?；線粒體排列不規(guī)律，胞漿基質(zhì)疏松變淡，明暗帶模糊不清，Z線部分?jǐn)嗔?，線粒體排列不規(guī)律，局部放大可見Z線水紋狀，模糊不清，部分?jǐn)嗔训?。橫切面上，粗細肌絲不規(guī)律排列，可見部分融合現(xiàn)象，可見粗肌絲周圍繞7～8個細肌絲，另有粗肌絲周圍圍繞5個清晰的細肌絲(圖1)。

圖1 大鼠腓腸肌透射電鏡觀察

3 討論

骨骼肌纖維根據(jù)收縮特性和能量來源分為Ⅰ型和Ⅱ型(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx)。Ⅰ型肌纖維肌球蛋白ATP酶活性低，收縮速度相對較慢，但大量的線粒體使其具有強氧化活動的能力，因此可以持續(xù)低強度收縮；由于肌紅蛋白含量高，故呈紅色，又稱紅肌纖維，屬于慢收縮氧化性。Ⅱa型屬于快收縮氧化酵解型，Ⅱb型屬于快收縮酵解型，Ⅱx型是較少的未分化纖維，可見于妊娠30周之前[8-9]。

有研究顯示，痙攣肌肌纖維構(gòu)型以Ⅰ型纖維占優(yōu)勢[10-11]。這一組型有利于痙攣肌肉維持持續(xù)、耐疲勞、高張的肌張力狀態(tài)。

骨骼肌非正常收縮將導(dǎo)致其內(nèi)DNA甲基化水平的變化[12]。甲基化是最常見的DNA修飾之一[13]。DNA甲基化是轉(zhuǎn)錄活性的主要調(diào)節(jié)者，環(huán)境因素會影響甲基化水平，這可能與一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病有關(guān)。DNA甲基化水平對大腦各功能區(qū)的分布發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14-15]。

高張狀態(tài)下，骨骼肌可能進行表觀遺傳修飾，即DNA甲基化水平的改變；異常的甲基化水平反過來又加重痙攣肌肉的功能障礙。

本研究顯示，痙攣骨骼肌的甲基化水平低于正常肌肉；MHC-ⅠmRNA高表達。MHC-Ⅰ是肌球蛋白重鏈異形體之一，也是骨骼?、裥屠w維的重要組成部分，構(gòu)成Ⅰ型纖維特性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。MHC異形體是骨骼肌纖維類型的標(biāo)志性蛋白，而MHC異形體蛋白合成主要是受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控[16]。MHC-ⅠmRNA高表達表明痙攣骨骼肌以Ⅰ型纖維為主，與組織化學(xué)水平所觀察到的表現(xiàn)一致。Mikeska等認(rèn)為，DNA甲基化對相關(guān)基因的表達起抑制作用[17]。本研究支持這一觀點。

國外研究表明，環(huán)境因素可以影響呼吸鏈的電子正常傳遞，從而影響骨骼肌線粒體能量的產(chǎn)生，線粒體DNA編碼的蛋白質(zhì)翻譯缺陷會導(dǎo)致呼吸鏈中氧化磷酸化的過程紊亂，從而引起骨骼肌能量代謝失衡[18-19]。本研究電鏡觀察顯示，病變以線粒體和粗細肌絲改變?yōu)橹?，這可能與痙攣型骨骼肌維持高張狀態(tài)所需能量有關(guān)。Sakellariou等研究表明，正常的骨骼肌粗細肌絲排列規(guī)整，如一條粗肌絲周圍有6條細肌絲，而一條細肌絲周圍有3條粗肌絲[20-21]。

雖然本研究中痙攣型骨骼肌低甲基化水平與MHC-ⅠmRNA高表達量呈負(fù)相關(guān)，但不足以說明它與肌纖維構(gòu)型的相關(guān)性。本研究采用總甲基化水平代表肌球蛋白相關(guān)位點的甲基化水平，并不精確；MHC的異形體眾多，本研究只觀察MHC-Ⅰ，并不確定其他異形體的表達情況。此外，本研究只是初步探討了痙攣狀態(tài)對骨骼肌的超亞微結(jié)構(gòu)。如何選取合適的肌球蛋白相關(guān)位點以及肌球蛋白重鏈異形體，是以后的研究方向。

痙攣型骨骼肌近似一種老齡化狀態(tài)，其肌肉大小、收縮特性等有別于同齡骨骼肌[22]。骨骼肌的痙攣狀態(tài)阻礙功能的發(fā)揮，給康復(fù)帶來負(fù)面影響，尤其是對肌張力協(xié)調(diào)性要求比較高的精細運動功能，這極大地影響了患者生活質(zhì)量[23-25]。我們在進行抗痙攣康復(fù)治療的同時，如能更好地把握骨骼肌超亞微結(jié)構(gòu)的變化，能更好指導(dǎo)康復(fù)計劃的實施及康復(fù)效果的預(yù)測。

[1]Hurley DS,Sukal-Moulton T,Msall ME,et al.The cerebral palsy research registry:development and progress toward national collaboration in the united states[J].Child Neurol,2011,26 (12):1534-1541.

[2]Choi HF,Blemker SS.Skeletal muscle fascicle arrangements can be reconstructed using a Laplacian vector field simulation[J].PLoS One,2013,8(10):e77576.

[3]Morris RT,Spangenburg EE,Booth FW.Responsiveness of cell signaling pathways during the failed 15-day regrowth of aged skeletal muscle[J].JAppl Physiol,2004,96(1):398-404.

[4]Weisleder N,Takizawa N,Lin P,et al.Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy[J].Sci Transl,2012,4(139):139ra85.

[5]羅君,凌志強.DNA甲基化分析技術(shù)的研究進展[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(6):691-693.

[6]Zhou C,Shimazu T,Durduran T,et al.Acute functional recovery of cerebral blood flow after forebrain ischemia in rat[J]. Cereb Blood Flow Metab,2008,28(7):1275-1284.

[7]王江濤,毛英麗,李洪華,等.新生大鼠痙攣型腦癱動物模型構(gòu)建及評價的實驗研究[J].中國婦幼保健,2011,26(19): 2992-2995.

[8]Nordin M,Frankel VH.Basic Biomechanics of the Musculoskeletal System[M].Lippincott:Williams&Wilkins,2001: 100-111.

[9]Lauritzen HP,Brandauer J,Schjerling P,et al.Contraction and AICAR stimulate IL-6 vesicle depletion from skeletal muscle fibers in vivo[J].Diabetes,2013,62(9):3081-3092.

[10]Klyen BR,Scolaro L,Shavlakadze T,et al.Optical coherence tomography can assess skeletal muscle tissue from mouse models of muscular dystrophy by parametric imaging of the attenuationcoefficient[J].BiomedOptExpress,2014,5(4): 1217-1232.

[11]Suhr F,Gehlert S,Grau M,et al.Skeletal muscle function during exercise-fine-tuning of diverse subsystems by nitric oxide[J].Int J Mol Sci,2013,14(4):7109-7139.

[12]Barrès R,Yan J,Egan B,et al.Acute exercise remodels promoter methylation in human skeletal muscle[J].Cell Metab, 2012,15(3):405-411.

[13]Moore LD,Le T,Fan G,et al.DNA methylation and its basic function[J].Neuropsychopharmacology,2013,38(1):23-38.

[14]Sanchez-Mut JV,Aso E,Panayotis N,et al,DNA methylation map of mouse and human brain identifies target genes in Alzheimer's disease[J].Brain,2013,136(10):3018-3027.

[15]Bakulski KM,Dolinoy DC,Sartor MA,et al.Genome-wide DNA methylation differences between late-onset Alzheimer's disease and cognitively normal controls in human frontal cortex[J].Alzheimers Dis,2012,29(3):571-588.

[16]Andersen JL,Gruschy-Knudsen T,Sandri C,et al.Bed rest increases the amount of mismatched fibers in human skeletal muscle[J].Appl Physiol,1999,86(2):455-460.

[17]Mikeska T,Craig JM.DNA methylation biomarkers:cancer and beyond[J].Genes(Basel),2014,5(3):821-864.

[18]Kopajtich R,Nicholls TJ,Rorbach J,et al.Mutations in GTPBP3 cause a mitochondrial translation defect associated with hypertrophic cardiomyopathy,lactic acidosis,and encephalopathy[J].Am J Hum Genet,2014,95(6):708-720.

[19]Boczonadi V,Horvath R.Mitochondria:impaired mitochondrial translation in human disease[J].Int J Biochem Cell Biol, 2014,48(5):77-84.

[20]Sakellariou GK,Vasilaki A,Palomero J,et al.Studies of mitochondrial and nonmitochondrial sources implicate nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase(s)in the increased skeletal muscle superoxide generation that occurs during contractile activity[J].Antioxid Redox Signal,2013,18(6): 603-621.

[21]Li Y,Lai N,Kirwan JP,et al.Computational model of cellular metabolic dynamics in skeletal muscle fibers during moderate intensity exercise[J].Cell Mol Bioeng,2012,5(1):92-112.

[22]Garvey SM,Dugle JE,Kennedy AD,et al.Metabolomic profiling reveals severe skeletal muscle group-specific perturbations of metabolism in aged FBN rats[J].Biogerontology, 2014,15(3):217-232.

[23]Klotz MC,Kost L,Braatz F,et al.Motion capture of the upper extremity during activities of daily living in patients with spastic hemiplegic cerebral palsy[J].Gait Posture,2013,38 (1):148-152.

[24]Palomero J,Vasilaki A,Pye D,et al.Aging increases the oxidation of dichlorohydrofluorescein in single isolatedskeletal muscle fibers at rest,but not during contractions[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2013,305(4):R351-R358.

[25]Yang YB,Zhang J,Leng ZP,et al.Evaluation of spasticity after stroke by using ultrasound to measure the muscle architecture parameters:a clinical study[J].Int J Clin Exp,2014,7(9): 2712-2717.

DNAMethylation and Muscle Fiber Configuration on Skeletal Muscle in Spastic Paralysis Rats

WANG Yu-chang1,PANG Wei1,FENG Huan-huan1,LIU Shi-zhen2,ZHANG Hui3
1.Rehabilitation Medical Research Institute of Jiamusi University,Jiamusi,Heilongjiang 154002,China;2.Shandong Jining No.1 People's Hospital,Jining,Shandong 272000,China;3.Yanzhou Tielu Hospital,Jining,Shandong 272100,China

Objective To investigate the DNA methylation of skeletal muscle in spastic paralysis rats and correlation with the muscle fiber configuration.Methods 100 5-day old Wistar rats were randomly divided into model group and control group.The former was established the spastic paralysis modle and reared for 30 days.Then,tissues from the gastrocnemius of all the rats were observed with triplicate DNA methylation,myosin heavy chain-I(MHC-I)mRNA with RT-PCR and transmission electron microscopy.Results The DNA methylation was(4.95±0.83)×10%in the model group,significantly less than(6.59±0.75)×10%in the control group(P＜0.001);while the MHC-I mRNA was(1.23±0.31),significantly more than(0.44±0.29)in the control group(P＜0.001).The Z-line was disordered,and the mitochondria near the Z-line increased,with edema and partially broken in cristae.The balance between the thick and thin filaments was broken,and myofibrils envelope fused.Conclusion Hypomethylation and hyperexpression of MHC-I mRNA have been found in skeletal muscle of spastic paralysis rats,which may result in type I fibers increase.However,there was no sufficient evidence to support the correlation between the DNAmethylation and the secondary pathological changes.

spastic paralysis;methylation;ultrastructure;myosin heavy chain-I

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.006

R742.3

A

1006-9771(2015)05-0519-05

2015-01-05

2015-03-02)

1.黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項目(No.LM2014-049)；2.佳木斯大學(xué)校級科技創(chuàng)新團隊項目(No.Cxtd-2013-02)。

1.佳木斯大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院暨黑龍江省小兒腦癱防治療育中心，佳木斯大學(xué)兒童神經(jīng)康復(fù)實驗室，黑龍江佳木斯市154002；2.濟寧市第一人民醫(yī)院，山東濟寧市272000；3.濟寧市兗州區(qū)鐵路醫(yī)院，山東濟寧市272100。作者簡介：王玉昌(1987-)，男，漢族，山東曹縣人，碩士研究生，主要研究方向：小兒腦損傷的發(fā)病機制和防治研究。通訊作者：龐偉，男，副教授、副主任醫(yī)師。E-mail:pangwei76@aliyun.com。