張 杰 邵 勇 于 波

2型單純皰疹病毒對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL－17和IL－23 mRNA的影響

張 杰 邵 勇 于 波

目的: 檢測(cè)2型單純皰疹病毒(HSV－2)感染后HaCaT細(xì)胞分泌IL－17、IL－23 mRNA的水平變化，明確IL－17和IL－23與角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)是否參與了HSV－2病毒感染初期的免疫防御機(jī)制。方法: 用HSV－2病毒感染HaCaT細(xì)胞，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)感染后24 h、48 h、72 h及空白對(duì)照組IL－17、IL－23mRNA的表達(dá)。結(jié)果: HSV－2病毒感染后72 h HaCaT細(xì)胞分泌IL－17mRNA的表達(dá)量低于對(duì)照組，而IL－23 mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論: 在HSV－2感染KC初期，IL－17和IL－23可能參與早期免疫防御反應(yīng)。

2型單純皰疹病毒； 角質(zhì)形成細(xì)胞； 白介素－17； 白介素－23

近年來研究發(fā)現(xiàn)KC不僅具有機(jī)械性屏障功能作用還具有分泌多種細(xì)胞因子的免疫防御能力，在原發(fā)性生殖器皰疹感染過程初期，KC起到了第一道防御屏障的作用。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)在生殖器皰疹病毒感染早期，KC能直接分泌IFNα1、α2、β1對(duì)HSV進(jìn)行天然免疫作用。1本文對(duì)HSV－2感染KC早期KC分泌IL－17、IL－23進(jìn)行檢測(cè)，以探討KC在HSV－2感染早期免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人永生化表皮細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。非洲綠猴腎細(xì)胞株VERO細(xì)胞、人單純皰疹病毒II型:均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所段書敏教授提供。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640和DMEM干粉、胎牛血清、胰蛋白酶和細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素－鏈霉素:GIBCO公司。Trizol、SYBR Green:Invitrogen公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)、tag酶、dNTP:Fermentas。WST1試劑盒:Takara公司。PCR引物:上海生工，引物序列，見表1。

1.1.3 儀器及器材 CO2孵箱(美國(guó)熱電3111型)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus CKX41型)，普通PCR儀(Bio－RAD)，熒光定量 PCR儀(Bio－RAD Chromo4)，DNA凝膠分析系統(tǒng)(美國(guó)Wealltec)，酶標(biāo)儀(Bio－RAD Model 680型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞與 VERO細(xì)胞均在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，另加10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和50 U/m L鏈霉素。細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到70%密度時(shí)進(jìn)行傳代，傳代時(shí)去除培養(yǎng)液，使用DPBS潤(rùn)洗細(xì)胞1次，加入0.25%胰蛋白酶，37℃、5%CO2條件下消化5 min，消化后按照1∶10比例傳代。

1.2.2 HSV－2病毒擴(kuò)增 將VERO細(xì)胞培養(yǎng)至90%密度，換用無血清的 DMEM培養(yǎng)基，將病毒液以1∶100體積比加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)達(dá)到70%細(xì)胞發(fā)生破碎后，收集全部細(xì)胞和培養(yǎng)基，凍存于－80℃。將

凍存病毒液于室溫融化，再次復(fù)凍于－80℃。反復(fù)3次，使全部VERO細(xì)胞破裂，釋放病毒。將病毒液于室溫12 000 g離心15 min，保存上清，用做病毒計(jì)數(shù)和感染使用。

1.2.3 HSV－2病毒計(jì)數(shù) 制備1%瓊脂糖培養(yǎng)基，方法如下:將0.2克瓊脂糖加入2 mL DPBS中，高溫高壓滅菌15 min。滅菌后加入含有10%胎牛血清和青霉素－鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基18 mL，混勻，40℃水浴保存。將VERO細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板，接種8 h后按照10－2到10－7等級(jí)稀釋比例接種病毒液。病毒感染后1 h，去除培養(yǎng)基，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)基2 mL/孔，室溫凝固，于37℃、5%CO2條件下孵育。連續(xù)觀察7～10 d，進(jìn)行空洞計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒濃度。

1.2.4 HSV－2病毒感染HaCaT細(xì)胞 將3×106個(gè)HaCaT細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼附后加入病毒液，終濃度為0.1PFU。對(duì)照組為同體積滅活病毒液(將病毒液于56℃水浴孵育2 h滅活)。病毒感染后3 h，更換為新鮮培養(yǎng)基。從加入病毒開始計(jì)時(shí)，分別培養(yǎng)細(xì)胞24 h、48 h、72 h。

1.2.5 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 在不同時(shí)間點(diǎn)取感染后的HaCaT細(xì)胞，吸取培養(yǎng)液－80℃保存，細(xì)胞層中加入1 m L Trizol試劑，室溫孵育5 min，吸取Trizol細(xì)胞裂解液，加入0.2 m L氯仿，混勻，室溫孵育2 min，12 000 g于4℃離心15 min，離心后將上層無色水相層吸出保留，加入0.5 mL異丙醇，混勻，室溫孵育10 min，12 000 g于4℃離心10 min。去除上清，使用70%乙醇清洗沉淀，7500 g于4℃離心5 min，去除上清，空氣干燥10 min。加入DEPC水溶解RNA，測(cè)量RNA濃度。取1 g RNA進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，方法根據(jù)RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進(jìn)行。獲得cDNA后使用GAPDH引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)cDNA質(zhì)量。PCR擴(kuò)增條件如下:95℃預(yù)變性5min，繼之進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，包括95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，最后72℃延伸10 min。將5μL擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠分析系統(tǒng)觀察照相。

1.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR PCR反應(yīng)體系中加入SYBR Green染料以及不同引物，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。PCR擴(kuò)增條件如下:95℃預(yù)變性5 min，繼之進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，包括95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。

1.2.7 實(shí)驗(yàn)4～6步重復(fù)3次。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSV－2病毒濃度計(jì)數(shù)結(jié)果 HSV－2經(jīng)接種孵育后，連續(xù)觀察7～10 d，進(jìn)行空洞計(jì)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中病毒液滴度計(jì)數(shù)結(jié)果為1×107PFU/mL。

2.2 HSV－2感染HaCaT細(xì)胞IL－17的表達(dá) 經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，IL－17 mRNA表達(dá)量比對(duì)照組顯著降低(表1，圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 HSV－2對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL－17的影響

圖1 HSV－2對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL－17的影響

2.3 HSV－2感染HaCaT細(xì)胞IL－23的表達(dá) 經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，IL－23 mRNA表達(dá)量比對(duì)照組顯著升高(表2，圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 HSV－2對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL－23的影響

圖2 HSV－2對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL－23的影響

3 討論

HSV－2病毒是一種有包膜的DNA病毒，主要通過直接接觸皮膚及黏膜引起感染，對(duì)于防范HSV－2病毒感染的第一道屏障－KC逐漸成為研究熱點(diǎn)。表皮不僅是機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的機(jī)械屏障，它還是一個(gè)活躍的免疫器官，其中作用之一是在炎癥反應(yīng)中起主要作用的細(xì)胞因子產(chǎn)生，且與機(jī)體總的反應(yīng)相一致。機(jī)體接觸HSV－2病毒感染后首先在角質(zhì)形成細(xì)胞中大量復(fù)制并擴(kuò)散感染其他細(xì)胞，引起表皮炎癥和壞死，因此研究生殖器皰疹感染初期作為第一道屏障的角質(zhì)形成細(xì)胞的免疫狀態(tài)具有重要的意義。

IL－17主要由Th17細(xì)胞分泌，還可以由巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生。2本研究證實(shí)IL－17亦可以由KC產(chǎn)生。既往研究認(rèn)為IL－17參與了機(jī)體抗感染免疫過程，包括真菌感染、3細(xì)菌感染、寄生蟲感染及病毒感染。4在抗病毒方面，大多數(shù)研究表明在急性病毒感染期IL－17表達(dá)上升，部分研究證實(shí)IL－17可誘導(dǎo)人表皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌IL－6、IL－8、粒細(xì)胞集落刺激因子(G－CSF)和細(xì)胞間黏附分子(ICAM－1)，加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)。IL－17也參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化，對(duì)T細(xì)胞的活化起協(xié)同刺激作用，并能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，還可促進(jìn)NK細(xì)胞形成和IFN－γ的產(chǎn)生，以此來發(fā)揮其抗病毒作用。5在本研究中HaCaT細(xì)胞被HSV－2感染后24 h、48 h、72 h IL－17 mRNA表達(dá)量比對(duì)照組顯著降低，推測(cè)HSV－2感染KC后對(duì)KC產(chǎn)生了破壞效應(yīng)，使細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞功能部分破壞，導(dǎo)致IL－17表達(dá)減少，以此增加HSV－2感染的侵襲性。但同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在HaCaT細(xì)胞被HSV－2感染后24 h、48 h、72 h IL－23mRNA表達(dá)量比對(duì)照組顯著升高，尤其以48 h后分泌水平大幅上升。以往研究認(rèn)為IL－23是由樹突狀細(xì)胞和其它抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生，IL－23能誘導(dǎo)Th17的分化，且IL－23是分泌IL－17的效應(yīng)細(xì)胞發(fā)育的必需條件，在體內(nèi)對(duì)于維持Th17細(xì)胞的穩(wěn)定及增殖有重要影響。6本研究證實(shí)KC也可以分泌IL－23，并且在HSV－2感染時(shí)呈反應(yīng)性上升以促進(jìn)真皮Th17細(xì)胞分化并誘導(dǎo)IL－17產(chǎn)生，參與抗病毒作用。但在KC中是否存在IL－17/IL－23調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究表明在HSV－2感染KC早期，KC具有一定天然免疫防御作用，KC可通過分泌IL－17、IL－23等細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)抗病毒的免疫調(diào)節(jié)，調(diào)控或誘導(dǎo)機(jī)體免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)病毒感染早期天然免疫作用，從而對(duì)生殖器皰疹的早期防治提供理論基礎(chǔ)。

1張杰，鐘綺麗，朱亦男，等.2型單純皰疹病毒對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌I型干擾素的影響.中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2010，26(1): 20－22.

2Kom T，Bettelli E，Oukka M，et al.IL－17 and Th17 cells.Annu Rev Immunol，2009，27:485－517.

3 Zelante T，De luca A，Bonifazi P，et al.IL－23 and the Th17 pathway promote inflammation and impair antifungal immune resistance.Eur J Immunol，2007，37(10):2695－2706.

4 Lafdil F，MiUer AM，Ki SH，et al.Th17 cells and their associated cytokines in liver diseases.Cell Mol Immunol，2010，7(4): 250－254.

5 Bhave NS，Carson WE 3rd.Immunemodulation with interleukin－21.Ann N Y Acad Sci，2009，1182:39－46.

6Stockinger B，Veldhoen M.Differentiation and function of Th17 T cells.Curt OpinImmunol，2007，l9(3):281－286.

(收稿:2014－09－28 修回:2014－10－29)

Influence of HSV－2 on them RNA expression of IL－17 and IL－23m RNA secreated by HaCaT cell

ZHANG Jie，SHAO Yong，YU Bo.Department of Dermatology，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen，518036

Objective:To detect the changes of IL－17 and IL－23mRNA levels in HaCaT cells after infected by HSV－2，in order to determine whether or not the IL－17 and IL－23 are involved in the defense immune mechanism to HSV－2 infection.M ethods:The levels of IL－17 and IL－23mRNA in HaCaT cellswere detected by Real－time PCR after 24 h，48 h and 72 h after infected by HSV－2.Results:The level of IL－23 mRNA was higher than that in the control group after 72 h infected by HSV－2(P＜0.05)，while the level of IL－17 mRNA was lower than that in the control group(P＜0.05).Conclusion:IL－17 and IL－23 may play an important role in the defense immunemechanism of KC to HSV－2 in the early stage of the infection.

HSV－2；Keratinocyte；IL－17；IL－23

北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳，518036