王德全王玉國陳宗燕劉保國苗國英張合恩吳 平姜 斌

糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性與大皰性類天皰瘡糖皮質(zhì)激素抵抗的相關(guān)性研究

王德全1王玉國2陳宗燕2劉保國3?苗國英3張合恩3吳 平3姜 斌3

目的: 檢測糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)位點(diǎn)(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)，明確其與大皰性類天皰瘡糖皮質(zhì)激素(以下簡稱激素)抵抗的相關(guān)性。方法: 提取激素敏感組(40例)、激素抵抗組(48例)及健康對(duì)照組(42名)外周血DNA，應(yīng)用SNaPshotSNP分型技術(shù)進(jìn)行GR基因多態(tài)性位點(diǎn)(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)檢測。結(jié)果: 激素敏感組、激素抵抗組和健康對(duì)照組均檢出BclI有3種基因型CC、CG、GG，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；N363S、ER22/23EK、9β基因位點(diǎn)不存在多態(tài)性。結(jié)論: GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β多態(tài)性與BP激素抵抗可能無相關(guān)性。

糖皮質(zhì)激素受體； 基因多態(tài)性； 大皰性類天皰瘡

大皰性類天皰瘡(BP)是一個(gè)好發(fā)于老年人的大皰性皮膚病?；颊卟∏檩^重，臨床上以軀干、四肢出現(xiàn)張力性大皰為主要特點(diǎn)，黏膜損傷較為少見。1糖皮質(zhì)激素是治療大皰性類天皰瘡(BP)的首選藥物。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC，簡稱為激素)的效應(yīng)由糖皮質(zhì)激素受體(GR)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)，然而GC治療存在個(gè)體差異，甚至出現(xiàn)治療抵抗。有研究報(bào)道，2，3糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性對(duì)GR功能產(chǎn)生影響，被認(rèn)為是GC抵抗的重要分子機(jī)制之一。本研究通過分析糖皮質(zhì)激素受體(GR)基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β單核苷酸多態(tài)性(SNP)，探討其與大皰性類天皰瘡激素抵抗的相關(guān)性，為闡明激素抵抗形成機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 臨床診斷參照《中國臨床皮膚病學(xué)》和《皮膚性病學(xué)》制定的BP診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、組織病理及免疫熒光病理確診。4回顧既往病案，據(jù)患者病情輕重，GC治療量相當(dāng)于潑尼松0.5～1.0 mg/(kg·d)，1周內(nèi)病情得到控制，列入激素敏感組，如1周內(nèi)病情未控制，則在原有劑量的基礎(chǔ)上增加50%，如果1.5 mg/(kg·d)仍未能控制病情，則該患者列入激素抵抗組，如果患者控制病情的GC用量≤1.5 mg/(kg·d)，則列入激素治療敏感組。激素敏感型類天皰瘡患者40例、激素抵抗型類天皰瘡患者48例。外周血標(biāo)本取自河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院2006年1月至2013年12月皮膚科門診及住院患者，健康對(duì)照組42例外周血標(biāo)本采自河北工程大學(xué)附屬

醫(yī)院健康體檢者，無自身免疫性疾病病史。各組研究對(duì)象均為河北籍漢族。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 從患者外周血提取基因組DNA，抽提方法參照試劑盒(DP318離心柱型，北京TIANGEN公司)說明書進(jìn)行操作，DNA樣品置于－20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 在Pubmed SNP入口檢索GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β的SNP位點(diǎn)相關(guān)信息，并參考文獻(xiàn)資料，5使用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增目的基因 使用1管便攜式PCR擴(kuò)增試劑/2×Taq PCR MasterMiX/KT201－01(北京TIANGEN公司)。PCR反應(yīng)條件:95℃變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行42個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 取混勻的PCR產(chǎn)物6μL點(diǎn)樣，陰性對(duì)照上樣量為10μL，每點(diǎn)樣一次均換槍頭，避免污染產(chǎn)物。在本次的電泳圖中，所使用的marker均為DL2000 marker(條帶由下至上分別為100 250 500 750 1000 2000，圖1)。

1.2.5 PCR產(chǎn)物序列分析 純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶消化后，送北京金維智公司進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算各組各位點(diǎn)基因型分布頻率及等位基因頻率，確認(rèn)其符合Hardy－Weinberg平衡。各組間等位基因和基因型比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組基因位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn) 對(duì)敏感組、抵抗組和對(duì)照組4個(gè)SNP位點(diǎn)(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)分別進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，結(jié)果均P＞0.05，說明敏感組、抵抗組和對(duì)照組均符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體，具有群體代表性。

2.2 GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β多態(tài)性位點(diǎn)DNA片段測序圖 敏感組、抵抗組和對(duì)照組均檢出BclI(rs41423247)IVS1184＋646位點(diǎn)存在C→G的堿基變異(實(shí)驗(yàn)組測序圖見圖2)。N363S、ER22/ 23EK、9β3個(gè)基因位點(diǎn)未檢出堿基變異。

表1 4個(gè)基因位點(diǎn)PCR引物序列

圖1 瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 實(shí)驗(yàn)組BclI位點(diǎn)基因突變測序圖(紅框所示為基因突變位點(diǎn))

2.3 GR基因型的分布及等位基因頻率 BclI的3種基因型(CC、CG、GG)在敏感組、抵抗組和對(duì)照組中的分布如表2，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.886)。3組BclI等位基因G、C在敏感組頻率分別為19%和81%，在抵抗組分別為26%和74%，在對(duì)照組分別為22%和78%，3組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.962)。N363S、ER22/23EK、9β基因位點(diǎn)僅檢出一種基因型，分別為AA、GG、AA，基因分布頻率在敏感組、抵抗組和對(duì)照組均為100%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0，P＞0.05)，見表3。

表2 3組BclI位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表3 2組N363S、ER22、9β位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

3 討論

隨著人類基因組圖譜繪制的日益完善，其中蘊(yùn)含著眾多單核苷酸多態(tài)性(SNPs)已受到分子生物學(xué)研究者的普遍關(guān)注和研究。因?yàn)镾NPs是用以確定候選基因的新一代遺傳標(biāo)記，有助于發(fā)現(xiàn)人類的一些復(fù)雜疾病相關(guān)基因。另外，也越來越多地用來探討同一基因、不同基因的SNPs連鎖關(guān)系，及其與疾病易感性、致病性等關(guān)系。

研究表明，糖皮質(zhì)激素受體基因存在多個(gè)多態(tài)性基因位點(diǎn)，其中包括N363S、ER22/23EK、BclI、9β、 D641V等，突變可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性喪失或下降、一些多態(tài)性基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物活性降低甚至不具有生物活性等，最終導(dǎo)致受體表達(dá)數(shù)量降低或受體親和力下降。6，7因此，GR基因多態(tài)性與激素抵抗現(xiàn)象很可能有關(guān)。

N363S多態(tài)性是位于GR基因2號(hào)外顯子上，N363S多態(tài)性是指野生型的1220位上的堿基A被G替代，其編碼363號(hào)氨基酸由天冬酰胺變成絲氨酸，絲氨酸殘基可以提供磷酸化位點(diǎn)，高度磷酸化的GR基因表達(dá)增強(qiáng)，因而提高了GR對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感

性。8有報(bào)道稱相比正常的GR，N363S能夠調(diào)節(jié)一些新的基因，其產(chǎn)生的影響可能提高GC的敏感性，但具體機(jī)制至今尚未十分清楚。9對(duì)于該多態(tài)性與疾病的關(guān)系，國內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了很多研究，主要集中在與代謝性疾病和心血管疾病的關(guān)系上。而對(duì)于N363S多態(tài)性與 BP的研究甚少。本研究對(duì)3組N363S基因多態(tài)性進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)，敏感組、抵抗組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)N363S存在多態(tài)性，基因型均為AA，表明GR基因N363S多態(tài)性與BP激素抵抗可能無明顯相關(guān)性。

ER22/23EK多態(tài)性位于GR基因2號(hào)外顯子上，是22號(hào)和23號(hào)密碼子上兩個(gè)連鎖的單核苷酸突變，其中22號(hào)密碼子上突變(GAG突變?yōu)镚AA)不會(huì)引起氨基酸改變均編碼谷氨酸，但是后一個(gè)突變(AGG突變?yōu)锳AG)使精氨酸變成賴氨酸。10這兩種多態(tài)性變化改變了受體表達(dá)和功能，從而影響了疾病易感性及臨床表現(xiàn)多樣性，對(duì)GC療效也有一定程度的影響。本研究對(duì)3組ER22/23EK多態(tài)性的檢測結(jié)果顯示:基因型均為GG，無突變型存在，從而表明與BP抵抗無相關(guān)性。

BclI多態(tài)性是指位于在GR基因2號(hào)外顯子下游646位點(diǎn)處有一突變:C→G，可能產(chǎn)生2.2 kb和3.9 kb長度的兩個(gè)片段。11文獻(xiàn)報(bào)道中，與臨床關(guān)聯(lián)最多的人類糖皮質(zhì)激素基因(nuclear receptor superfamily3，groupC，member1，NR3Cl)的多態(tài)性位點(diǎn)就是BclI，該位點(diǎn)存在CC、CG、GG 3種基因型。通過影響GR來提高糖皮質(zhì)激素(GC)的敏感性，由于BclI多態(tài)性在內(nèi)含子，既不與編碼氨基酸的密碼子有關(guān)，也不與基因的調(diào)節(jié)和斷裂點(diǎn)有關(guān)，故糖皮質(zhì)激素治療BP產(chǎn)生激素抵抗及耐藥機(jī)制尚不清楚，可能是因位于基因編碼的起始區(qū)，或者與某個(gè)具有功能的重要多態(tài)性相連等。12研究發(fā)現(xiàn)，敏感組、抵抗組和對(duì)照組BclI位點(diǎn)基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3組人群等位基因C所占比例均為80%左右，提示可能存在種族特異性。國內(nèi)對(duì)BclI基因多態(tài)性與BP激素抵抗的研究較少，本研究雖得出陰性結(jié)果，但仍需在更大樣本人群中進(jìn)行重復(fù)研究及對(duì)BclI基因多態(tài)性與BP治療反應(yīng)性進(jìn)行相關(guān)性研究。

9β是GR外顯子9β上ATTTA→GTTTA，A→G的核苷酸突變導(dǎo)致GRβmRNA轉(zhuǎn)錄增多，抑制GRa與激素的結(jié)合，從而降低細(xì)胞對(duì)激素的敏感性，導(dǎo)致激素耐受。南亞人群中該等位基因G的頻率為0.166，與歐洲人群篩查結(jié)果相同。13目前在中國人群中對(duì)該位點(diǎn)的臨床意義尚無相關(guān)研究。本研究顯示，該位點(diǎn)僅發(fā)現(xiàn)基因型AA，未發(fā)現(xiàn)其他等位基因，與BP激素抵抗無明顯相關(guān)性。

此次研究未能發(fā)現(xiàn)BP與GR基因N363S、ER22/ 23EK、BclI、9β位點(diǎn)SNP相關(guān)性，分析原因可能是: (1)GR基因可能與BP激素抵抗相關(guān)性較低。(2)本研究尚有自身局限性，只選取了GR基因的4個(gè)位點(diǎn)，研究范圍較窄，GR基因其他位點(diǎn)多態(tài)性與BP激素抵抗關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。(3)未發(fā)現(xiàn)N363S、ER22/23EK、9β多態(tài)性存在，說明這3個(gè)位點(diǎn)在漢族人群中突變率較低，甚至可能不存在突變。本文只是對(duì)GR基因多態(tài)性與BP激素抵抗的初步研究，對(duì)于GR基因多態(tài)性與GC治療療效的關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。該研究可能由于樣本量小，其確切結(jié)論尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

1王維，陳丹.大劑量靜脈用人免疫球蛋白沖擊療法聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療大皰性類天皰瘡的臨床觀察及護(hù)理.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(5):192－193.

2 Bhandare R，Damera G，Baneriee A，et al.Glucocorticoid receptor interacting protein－I restores glucocorticoid responsiveness in steroid resistant airway structural cells.Am JRespir Cell Mol Biol，2010，42(1):9－15.

3Maltese P，Canestrari E，Palma L，et al.High resolution melting(HRM)analysis for the detection of ER22/23EK，BclI，and N363S polymorphisms of the glucocorticoid receptor gene.Steroid Boichem Mol Biol，2009，113(3/5):269－274.

4張學(xué)軍.皮膚性病學(xué).8版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2013.150－155.

5Russcher H，van Rossum EF，de Jong FH，etal.Increased expression of the glucocorticoid receptor a translational isoform as a result of the ER22/23EK polymorphism.Mol Endocrinol，2005，19(7):1687－1696.

6Bray PJ，Cotton RG.Variations of the human glucocorticoid receptor gene(NR3C1):pathological and in vitro mutations and polymorphisms.Hum Mu Tat，2003，21(6):557－568.

7 Charmandari E，Kino T，Chrousos GP.Fam ilial/sporadic glucocortcoid resistance:clinical phenotype and molecular mechanisms.Ann N Y Acad Sci，2004，1024:168－181.

8 Panek M，Pietras T，Antczak A，et al.The role of functional single nucleotide polymorphisms of the human glucocorticoid receptor gene NR3C1 in Polish patientswith bronchialasthma.Mol Biol Rep，2012，39(4):4749－4757.

9 Jewell CM，Cidlowski JA.Molecular evidence for a link between the N363s glucocorticoid receptor polymorphism and altered gene expression.JClin Endocrinol Metab，2007，92(8):3268－3277.

10范飛，鮑一笑，華麗，等.糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性與漢族兒童哮喘關(guān)系研究.中國實(shí)用兒科雜志，2013，28(2):114－117.

11 Fleury I，Beaulieu P，Primeau M，etal.Characterization of the BclI polymorphism in the glucocorticoid receptor gene.Clin Chem，2003，49(9):1528－1531.

12Manenschijn L.Clinicalures associated with glucocorticoid receptor polymorphisms.An overview.Ann NY Acad Sci，2009，

1179(16):179－198.

13 Marino S，Verzegnassi F，Tamaro P，et al.Response to glucocorticoids and toxicity in Childhood acute lymphoblastic leukemia:role of polymorphisms of genes involved in glucocorticoid response.Pediatr Blood Cancer，2009，53(6):984－991.

(收稿:2014－09－19 修回:2014－11－06)

Correlation between glucocorticoid recep tor gene polymorphism and glucocorticoid resistance in the patients w ith bullous pem phigus

WANG De-quan，WANG Yu-guo，CHEN Zong-yan，et al.Chengde Medical College，Chengde，067000

Objective:To detect the genotype frequency of polymorphic loci(N363S，ER22/23EK，BclI，9β)of glucocorticoid receptor(GR)gene to determine the correlation between glucocorticoid receptor gene polymorphism and glucocorticoid resistance in the patientswith bullous pemphigus(BP).M ethods:Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the patients in the glucocorticoid sensitivity group(40 patients)，glucocorticoid resistance group(48 patients)and 42 healthy controls.Themutations in polymorphic lociwere detected by SNaPshotSNP.Resu lts:Three kindsofgenotypes(CC，CG and GG)of BclIwere identified in the three groups，with no significantdifference among them(P＞0.05).Therewas no polymorphism of N363S，ER22/23EK and 9βin the three groups.Conclusion:The polymorphism of GR genemay not be correlated with the glucocorticoid resistance in the patientswith BP.

glucocorticoid receptor；gene polymorphism；bullous pemphigoid

1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德，067000 2東平縣皮膚病防治所，山東東平，271500 3河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲，056002?通信作者