熊 娟

(湖北省黃石市中醫(yī)醫(yī)院婦科，湖北黃石 435000)

宮頸癌是三大婦科惡性腫瘤之一，死亡率排名第二，僅次于乳腺癌［1］。宮頸癌特點具有侵襲能力強、惡性程度高、早期可由淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的特點。宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，經(jīng)歷宮頸不典型增生、原位癌、微小浸潤癌、浸潤癌等動態(tài)演進過程。宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展與基因異常表達、癌基因激活、DNA損傷修復(fù)、DNA轉(zhuǎn)錄表達失控、抑癌基因失活等相關(guān)，最根本的表現(xiàn)為細胞周期調(diào)控機制紊亂［2］。細胞周期調(diào)控蛋白失調(diào)可作為導(dǎo)致腫瘤的原因之一［3］。惡性腫瘤擁有侵襲和轉(zhuǎn)移的最重要的生物學(xué)特征，侵襲和轉(zhuǎn)移中藥的環(huán)節(jié)之一就是黏附力降低或者喪失，侵襲、轉(zhuǎn)移與預(yù)后密切相關(guān)，組織分型、臨床分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移等因素可反應(yīng)宮頸癌惡性程度及預(yù)后［4］。本文采用免疫組織化學(xué)法檢測CDK8與KAI1的表達情況，分析兩組因子與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2010年2月—2014年4月黃石市中醫(yī)醫(yī)院保存的石蠟組織標本，宮頸癌組織36例，其中宮頸腺癌17例，鱗癌19例。根據(jù)2000年FIGO臨床分期標準，Ⅰ期15例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例;按病理分化程度，Ⅰ級17例，Ⅱ級11例，Ⅲ級8例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例;宮頸上皮內(nèi)瘤變組織(CIN)110例，其中宮頸低度病變組(CINⅠ50例)，宮頸高度病變組(CINⅡ30例、CINⅢ30例);正常宮頸組織20例?；颊吣挲g29～68歲，中位年齡50歲，患者均未經(jīng)過放化療等特殊方式治療。標本處理:經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋標本，以5 μm厚度切片代用。對36例宮頸癌患者進行1～4年的隨訪，統(tǒng)計不同分組的死亡率。

1.2 儀器與試劑 免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色液均由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供，CDK8、KAI1綿羊抗人多克隆抗體由 R＆D公司提供，CDK8、KAI1鼠抗人單克隆抗體工作液由福建邁新生物技術(shù)有限公司提供，已知的CDK8、KAI1陽性對照染色片。

1.3 實驗方法 (1)CDK8蛋白的檢測:采用免疫組織化學(xué)染色法，采用二甲苯脫蠟及梯度酒精水化處理切片后，加入少量3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化酶活性，加入一定量的枸櫞酸鈉(濃度:0.01 mol·L－1，pH6.0，100℃)修復(fù)抗原 10 min 后，用 PBS 沖洗4遍，在10%BSA的環(huán)境中封閉非特異性位點10 min。再加入鼠抗人CDK8單克隆抗體于4℃孵育過夜，然后用PBS沖洗3遍，加入CDK8綿羊抗人多克隆抗體于20℃孵育1 h，用PBS沖洗5遍，最后進行DAB顯色觀察。(2)KAI1蛋白的檢測:采用免疫組織化學(xué)染色法，操作方法同上，嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作。

1.4 結(jié)果判定 CDK8、KAI1結(jié)果判定:于400倍光鏡下觀察，隨機選取正常宮頸組織切片、CIN組織切片、宮頸癌切片上5個視野，運用奧林巴斯顯微鏡拍下視野圖像，使用IPP6.0軟件處理，將圖像灰度值轉(zhuǎn)換成吸光度值，計算出平均吸光度值(OD)=累積吸光度/面積。陽性對照采用已知的陽性對照染色片，陰性對照采用PBS代替鼠抗人CDK8、KAI1單克隆抗體為對照。KAI1陽性表達為在細胞膜或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒。

2 結(jié)果

2.1 CDK8在宮頸癌及 CIN組織中的表達CDK8在組織細胞內(nèi)陽性表達，細胞核顯示為棕黃色。正常宮頸組織中幾乎沒有陽性細胞(圖1a);CINⅢ組織細胞中表達，陽性細胞較正常宮頸明顯增加(圖1b);宮頸腺、鱗癌組織陽性細胞棕黃色較深，細胞核增大異型(圖1c);CDK8在各組間表達，宮頸低度病變組顯著強于正常宮頸組(P＜0.05)，宮頸高度病變組顯著強于宮頸低度病變組(P＜0.05)，宮頸癌組顯著強于宮頸高度病變組(P＜0.05)，見表1。

2.2 CDK8表達與宮頸癌臨床特征的關(guān)系及預(yù)后單因素分析結(jié)果顯示，CDK8早宮頸癌組織表達與年齡、宮頸癌組織分型、臨床分期、細胞分化程度相關(guān)因素?zé)o關(guān)(P＞0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。見表2。對36例患者進行隨訪結(jié)果，臨床分期Ⅰ期死亡2例，死亡率13.33%;Ⅱ期死亡3個，死亡率 20.08%;Ⅲ期死亡 3例，死亡率 37.50%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組死亡7例，死亡率46.67%;淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組死亡4例，死亡率19.05%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組死亡率顯著高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。

2.3 KAI1在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中的表達及預(yù)后 正常宮頸組織KAI1可明顯觀察到棕黃色陽性細胞的存在，隨著病情的發(fā)展，棕黃色陽性細胞逐漸減少。見圖2A～E。KAI1蛋白在正常宮頸組織、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組織、宮頸癌組織的陽性表達率分別為100%、68.00%、53.00%、40.00%、16.67%;KAI1 在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ組織的表達顯著強于在宮頸癌組織(P＜0.05)，在正常宮頸組織、CINⅠ的表達顯著強于在CINⅢ(P＜0.05)，在正常宮頸組織表達顯著強于在CINⅡ(P ＜0.05)。見表3。

表1 CDK8在各組織表達的平均吸光度比較

表2 CDK與宮頸癌臨床特征關(guān)系單因素分析結(jié)果

表3 KAI1在各組織中陽性表達率

2.4 KAI1表達與宮頸癌臨床特征的關(guān)系及預(yù)后KAI1在宮頸癌組織中的表達均與年齡、組織分型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05)。見表4。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展與基因異常表達、癌基因激活DNA損傷修復(fù)、DNA轉(zhuǎn)錄表達失控、抑癌基因失活等相關(guān)，最根本的表現(xiàn)為細胞周期調(diào)控機制紊亂［5］。細胞周期調(diào)控蛋白失調(diào)可作為導(dǎo)致腫瘤的原因之一［6－7］。主要的細胞周期調(diào)控分組有3大類:細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)、細胞周期蛋白(cyckins)、CDK抑制物(CKI)，它們之間相互作用進行精細與復(fù)雜的細胞周期調(diào)控。CDK是關(guān)鍵調(diào)控因子，能啟動DNA合成、促進細胞周期時相轉(zhuǎn)變、調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄，CDK活血受到cyslins正調(diào)控和CKIs負調(diào)控影響。CDK的活性異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系［8］。

表4 KAI1表達與宮頸癌臨床特征的單因素分析

CDK8屬于CDK家族一員，分子量為53～55 Ka，位于基因的13q12、13 段，能與 MED12、MED13、cyclinC結(jié)合組成四聚體調(diào)控復(fù)合物，MED12、cyclinC負責(zé)調(diào)節(jié)CDK8活性，MED13負責(zé)聚集CDK8到四聚體調(diào)控復(fù)合體。人體CDK8還有一種Ser酶，其能調(diào)節(jié)與 cyclins、CKI結(jié)合［9］。現(xiàn)代研究對CKD8具體致癌機制尚未明了，有相關(guān)研究表明，CDK8能正向調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ，間接抑制β-catenin的表達，增加P53轉(zhuǎn)錄中得協(xié)同激活作用，正向調(diào)節(jié)EGR轉(zhuǎn)錄因子促進細胞生長及血管生成等。目前研究表明CDK8異常表達對大腸癌、胃癌、惡性黑色素瘤的發(fā)生有重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，βcatenin、EGR轉(zhuǎn)錄因子、P53的異常表達與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，CDK8能正向調(diào)節(jié)EGR轉(zhuǎn)錄因子、P53的表達，負向調(diào)節(jié) β-catenin的表達。KAI1蛋白屬于四次跨膜超家族成員，分子量為29 610 Ka，長2.4 Kb，由267個氨基酸編碼組成，其結(jié)構(gòu)是細胞膜糖蛋白，主要分布在哺乳動物組織細胞及白細胞表面［10］。KAI1蛋白擁有一個大的細胞外親水結(jié)構(gòu)區(qū)和4各高度保守的疏水結(jié)構(gòu)區(qū)。KAI1主要參與細胞與細胞外基質(zhì)、細胞與細胞的相互作用及細胞的增殖活動［11］。KAI1蛋白能抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，對細胞活動、黏附能力、轉(zhuǎn)移增生有影響，并通過胞內(nèi)信號通路介導(dǎo)腫瘤細胞的活動。通過Qac GT Pase和Src激酶抑制腫瘤細胞增殖，激活T細胞與抗原提呈細胞，進而抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［12－13］。KAI1可在前列腺癌表達，也可在多種腫瘤(如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌)組織或者轉(zhuǎn)移病灶中表達，隨著病情的惡化，KAI1的表達呈下降或消失趨勢［14－15］。KAI1表達下降或者消失，可在不影響原發(fā)腫瘤生長的條件下，促進轉(zhuǎn)移瘤形成。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDK8與患者的生存率和預(yù)后有直接關(guān)系，KAI1蛋白尚未發(fā)現(xiàn)與宮頸癌預(yù)后相關(guān)。兩者之間并未存在直接關(guān)聯(lián)，兩者均可在組織或病灶中表達。

DK8在正常組織、CIN低度病變組織、CIN高度病變組織、宮頸癌組織中的表達呈顯著遞增的趨勢(P＜0.05)，CDK8在宮頸癌組織的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，36例宮頸癌患者隨訪后，臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期死亡率分別為 13.33%、20.08%、37.50%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移死亡率(46.67%)顯著大于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移(19.05%)，且有顯著性差異(P ＜0.05)，隨著病情的加重，CDK8表達增強，死亡率增大，說明CDK8的表達與患者的生存率和預(yù)后有直接關(guān)系;KAI1蛋白在正常宮頸組織、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ組織、宮頸癌組織的陽性表達率分別為 100%、68.00%、53.00%、40.00%、16.67%;KAI1在宮頸癌組織中的表達均與年齡、組織分型、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05);結(jié)果提示，KAI1蛋白表達可能與宮頸癌預(yù)后沒有關(guān)系，不能成為宮頸癌預(yù)后的一個有效指標。綜上所述，CDK8與患者的生存率和預(yù)后有直接關(guān)系，可作為宮頸癌預(yù)后的一項指標，而KAI1蛋白尚未發(fā)現(xiàn)與宮頸癌預(yù)后相關(guān)，需后續(xù)研究確認，為臨床提供了理論依據(jù)。

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