唐媛媛，莫緒維，陳 鶴，李 群，蔡亦紅，沈繼龍

(1.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原與免疫學實驗室，安徽合肥 230032;2.安徽省六安市人民醫(yī)院檢驗科，安徽六安 237000;3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽合肥 230022;4.安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗檢疫系，安徽合肥 230032;5.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院寄生蟲學教研室，安徽合肥 230032)

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)隸屬于頂復門，是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，可寄生在幾乎所有有核細胞中，可引起人獸共患弓形蟲病，對人類健康和畜牧業(yè)造成嚴重的危害。全世界約有1/3人感染弓形蟲病，我國的人群感染率為10%。在弓形蟲入侵過程中，微線體首先釋放出微線體蛋白，微線體蛋白的釋放會立刻觸發(fā)棒狀體分泌RONs［1］。棒狀體蛋白由蟲體前端的分泌器官ROP分泌，在蟲體入侵及納蟲空泡的形成過程中起重要的作用。大多數(shù)棒狀體蛋白(ROPs)定位在納蟲空泡(parasitophorous vacuole，PV)和納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)上，是弓形蟲入侵宿主細胞以及在宿主細胞中生存的必要條件［2］;同時作為一種重要的毒力因子在和宿主細胞的相互作用中也起到非常重要的作用。目前研究較多的為ROP1和ROP2，其中屬于ROP2家族的ROP2、ROP16、ROP18 具有良好的免疫原性和保護性［3－4］。在侵入宿主細胞后，ROP16會移位到宿主細胞核中，影響宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導(可能參與轉(zhuǎn)錄相關因子STAT3和STAT6的調(diào)節(jié)［5］。Murray等在研究中發(fā)現(xiàn)，Type I型弓形蟲是通過ROP16蛋白直接磷酸化STAT3/STAT6誘導巨噬細胞向M2型極化;而TypeⅡ型弓形蟲ROP16由于其氨基酸序列的503位點由亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸(ROP16 L503S)而使得其無法有效活化STAT3/STAT6［6］。結(jié)合這些研究成果，本實驗對流行于我國的優(yōu)勢基因型Chinese1基因型弓形蟲(Wh3株)ROP16進行研究，以期為我國優(yōu)勢基因型弓形蟲株的研究、弓形蟲主要抗原［7］及弓形蟲病疫苗的研究奠定基礎［8］。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗小鼠為SPF級BALB/C小鼠購于蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司［動物許可證號:SCXK(蘇)2014－0007］，6～8周，雌性，體重28～30 g，室溫下自由進食標準顆粒飼料、衛(wèi)生飲水;Chinese1基因型弓形蟲(Wh3株)株，大腸桿菌XL1-blue、BL21 和 DH5α，原核表達載體 pET-28a，真核表達載體pEGFP-C2，293T細胞均由本實驗室保種;引物由上海生物工程有限公司合成;TagDNA聚合酶，高保真PCR酶、dNTP、一步法RT-PCR試劑盒(Roche公司)，限制性內(nèi)切酶 NOT1、ECOR1，Kpn 1，pMD18-T，T4連接酶，PCR產(chǎn)物純化試劑盒，膠回收試劑盒均購自大連寶生物(TATARA)公司;小量質(zhì)粒提取試劑盒購于美國OMEGA公司;HRP標記抗小鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司;其它試劑系國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲速殖子DNA的提取 弓形蟲速殖子感染健康小鼠，待小鼠出現(xiàn)明顯的弓背、豎毛、活動減少等癥狀時脫頸處死小鼠，從小鼠腹水中收集弓形蟲速殖子，PBS洗滌后計數(shù)，根據(jù)蟲體數(shù)量加入Trizol裂解蟲體，提取蟲體總RNA，然后經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 弓形蟲ROP16基因的體外擴增和克隆 參照PUBMED上搜索到的RH株的ROP16基因序列，設計原核表達質(zhì)粒引物:上游引物:5'-gaattcatgaaagtgaccacgaaag-3'，下游引物:5'-gcggccgcctacatccgatgtgaagaaagtt-3';按照pEGFP-C2載體引物設計要求，設計真核表達質(zhì)粒引物:上游引物:5'-gaattcatgaaagtgaccacgaaag-3'，下游引物:5'-gggtacccctacatccgatgtgaagaaagtt-3'。以弓形蟲基因組DNA為模板，擴增弓形蟲ROP16基因，反應條件為:預變性2 min，94℃變性30 sec，64℃退火 30 sec，72℃延伸 2 min 30 s，35個循環(huán);1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T連接，后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue感受態(tài)細胞，菌落經(jīng)PCR和質(zhì)粒DNA序列分析鑒定陽性菌株。

1.2.3 原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 抽提含正確的插入片段的pMD-T質(zhì)粒和質(zhì)粒pET-28a質(zhì)粒，分別用NOT1、ECOR1進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將酶切后的載體和目的片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，菌落經(jīng)PCR和雙酶切鑒定。

1.2.4 ROP16基因在大腸埃希菌BL21中的誘導表達 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28a/ROP16單菌落接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，次日取200 μL于20 mL培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當A600值在0.4左右時加入IPTG至終濃度為1 mmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，后每隔1 h離心收集菌液，超聲波處理，高速離心后分離上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 重組蛋白的免疫反應性分析 重組陽性菌pET-28a-ROP16和空載體pET-28a轉(zhuǎn)化菌裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至NC膜，于37℃用BSA封閉2 h，以鼠抗弓形蟲血清(1∶50稀釋)為一抗，HRP標記抗小鼠IgG作二抗，進行Western blot，分析重組蛋白免疫反應性。

1.2.6 真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 抽提含有正確插入片段的pMD18-T的質(zhì)粒和 pEGFP-C2質(zhì)粒分別用NOT1、Kpn 1進行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切后的目的片段和載體，膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將酶切后的目的片段和載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞，菌落經(jīng)PCR和雙酶切鑒定。

1.2.7 真核表達質(zhì)粒在293T細胞中的表達 采用貼壁細胞的DNA轉(zhuǎn)染法，按脂質(zhì)體LipofectamineTM3000的使用說明進行。在轉(zhuǎn)染前一天將293T細胞轉(zhuǎn)入6孔板中培養(yǎng)，待細胞長至細胞瓶底70%～80%飽和度且細胞狀態(tài)良好是進行轉(zhuǎn)染。在無菌的1.5 mL離心管中準備下列溶液:溶液A:用無血清DMEM將4 μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA稀釋成250 μL;溶液B:用無血清DMEM將6 μL脂質(zhì)體 LipofectamineTM3000稀釋至250 μL;合并溶液 A和溶液B，輕輕混勻，室溫孵育20 min，以形成脂質(zhì)體-DNA復合物;將待轉(zhuǎn)染的細胞換液，用無血清的DMEM洗滌兩次;向混合液中加入1 mL 37℃預熱的無血清DMEM，輕輕混勻，緩慢加入待轉(zhuǎn)染細胞中;置CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育6 h后棄細胞上清，加入含10%小牛血清的DMEM細胞生長液，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;置倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8 RT-PCR法鑒定蛋白在細胞中的表達 將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后的細胞用(PBS)洗滌兩次之后，用Trizol裂解細胞，提取細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增;擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.9 生物信息學分析 蛋白質(zhì)生物學功能的發(fā)揮在很大程度上取決于其三維結(jié)構(gòu)，預測蛋白的三維結(jié)構(gòu)對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析及其功能預測都有很好的支持作用;本實驗采用能夠同源建模和從頭合成兩套不同算法I-TASSER預測ROP16基因的3D結(jié)構(gòu)，為進一步研究ROP16的結(jié)構(gòu)和功能提供科學資料［7］。

2 結(jié)果

2.1 原核表達載體的雙酶切鑒定 重組陽性菌pET-28a-ROP16經(jīng) NOT1、ECOR1雙酶切，獲得約5.3 kb和2.1 kb兩條帶，大小與載體片段和目的DNA長度相符(圖1)。

2.2 目的基因測序結(jié)果 經(jīng)上海生工測序TgCtwh3的ROP16基因序列擴增出2124 bp片段，與RH株ROP16基因序列99%同源;經(jīng)比對氨基酸序列503位點與RH株的ROP16序列503位點同為亮氨酸(圖2)。

2.3 原核表達質(zhì)粒在大腸埃希菌BL21中的表達將各小時留取的IPTG誘導表達的菌體超聲波破碎后進行SDS-PAGE電泳，在約77 kDa處有明顯條帶，重組蛋白分子質(zhì)量大小與預期一致。隨著誘導時間的延長，融合蛋白的表達量逐漸增加，在37℃1 mmol·L－1IPTG誘導6 h表達量最高(圖3)。

2.4 原核表達產(chǎn)物的Western blot鑒定 Western blot結(jié)果顯示，重組的pET-28a-ROP16蛋白能被鼠抗弓形蟲免疫血清識別，在77 kDa處可見一條識別條帶(圖4)。

2.5 真核表達質(zhì)粒在293T細胞中的表達 熒光倒置顯微鏡下觀察，可見細胞成功轉(zhuǎn)染進293T細胞中，說明所構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒在293T細胞中成功表達(圖5)。

2.6 RT-PCR法鑒定蛋白在細胞中的表達 用轉(zhuǎn)有pEGFP-C2-ROP16重組質(zhì)粒、pEGFP-C2空質(zhì)粒的293T細胞的總RNA作為模板分別進行RT-PCR擴增，只有轉(zhuǎn)染有pEGFP-C2-ROP16質(zhì)粒的可以擴增出約2 100 bp條帶，與ROP16基因片段大小相符(圖6)。

2.7 蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)圖 圖中白色“箭頭”標注的為503位點(圖7)。

3 討論

近些年來通過不同基因型蟲株雜交、基因敲除和轉(zhuǎn)基因弓形蟲蟲株實驗證實弓形蟲具有某些特定的毒力因子在誘導活化巨噬細胞、刺激宿主免疫反應上起關鍵作用［9］。目前已經(jīng)確定的毒力相關因子包括弓形蟲表面抗原(surface antigen，SAG)1、ROP5、ROP16、ROP18、致密顆粒蛋白(dense granule protein，GRA)7、GRA15等。其中 ROP16蛋白是一種具有多態(tài)性的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，同時具有酪氨酸激酶活性;在弓形蟲侵入宿主細胞的過程中由棒狀體釋放進入胞質(zhì)，然后迅速進入胞核，能夠直接磷酸化STAT3的Tyr705和STAT6的Tyr641殘基［10－11］。如前所述，Type I型(RH 株)弓形蟲是通過ROP16直接磷酸化STAT3/STAT6誘導巨噬細胞向M2型極化;而Type II型弓形蟲ROP16氨基酸序列的503位點由亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸(ROP16 L503S)而使得其無法有效活化STAT3/STAT6，可見ROP16蛋白在弓形蟲的入侵以及寄生的過程中起到非常重要的作用。Wh3株屬于Chinese1型弓形蟲，是中國優(yōu)勢基因型弓形蟲株，其毒力與RH株相似。小鼠梯度毒力實驗證實(資料為本實驗室所有)，接種同樣劑量的速殖子小鼠Wh3株可引起小鼠的死亡時間略遲于RH株，100個速殖子均可以導致小鼠100%死亡。

本實驗通過RT-PCR擴增出我們國家Wh3分離株的 ROP16蛋白，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn) WH3分離株ROP16蛋白序列503位點處為亮氨酸，那么由此猜測，我國的WH3分離株也可以直接磷酸化STAT3/STAT6，對巨噬細胞的偏移應答起到一定的調(diào)控作用;其次本實驗應用RT-PCR擴增TgCtwh3-ROP16基因片段，插入原核載體pET-28a的多克隆位點，經(jīng)雙酶切、PCR、測序鑒定確認，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a/ROP16，并在大腸埃希菌BL 21中高效表達，該重組蛋白以可溶的形式存在于超聲裂解的菌液的上清中，Western blot顯示該蛋白能被鼠抗弓形蟲血清所識別，表明其具有免疫原性;再次本實驗構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒，利用增強型綠色蛋白(EGFP)報告基因，產(chǎn)生的熒光較普通綠色熒光蛋白強35倍，大大增強了報告基因的敏感度［12］;本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組質(zhì)粒能夠成功的在293T細胞中表達并通過RT-PCR鑒定結(jié)果正確，但是轉(zhuǎn)染效率不高，約30%左右，分析可能與ROP16基因片段過大、ROP16蛋白本身屬于毒力因子不利于轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)染試劑的選擇有關;接下來會嘗試選擇其他轉(zhuǎn)染試劑以及構(gòu)建病毒包裝質(zhì)粒來進行轉(zhuǎn)染。所述，本實驗成功構(gòu)建了我國優(yōu)勢基因型WH3株的棒狀體ROP16蛋白的原核及真核重組表達質(zhì)粒，為我國優(yōu)勢基因型弓形蟲株的免疫特性、致病機制以及為我國的弓形蟲疫苗的研究打下了一定的基礎;其次成功構(gòu)建ROP16基因的3D結(jié)構(gòu)對于進一步深入的生物信息學分析以及蛋白的功能研究具有一定的導向意義［13］。

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