王雨艨，張亞中，吳德玲

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230031;2.安徽省毫州市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽毫州 236800;3.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051)

百蕊草(Thesium Chinense Turcz)別名有百乳草、珍珠草、白風(fēng)草、一棵松、細(xì)須草、地石榴等，是檀香科百蕊草屬多種植物藥材的統(tǒng)稱。百蕊草是百蕊草或者其變種長(zhǎng)梗百蕊草的干燥全草［1－5］，始載于《圖經(jīng)本草》，性寒而平緩，味微苦澀，具清熱解毒、通順氣脈、補(bǔ)腎澀精及調(diào)氣功效，有“植物抗生素”美稱。百蕊草常用于治療急性乳腺炎、急性扁桃體炎、上呼吸道感染、遺精、肺炎、咽炎、淋證、肺膿腫、淋巴結(jié)結(jié)核、乳蛾、乳癰、疔腫、黃疸以及腎虛腰痛、腎虛頭暈、各種感染等疾病，且無(wú)毒副作用［6］?！吨袊?guó)藥典》1977年版曾把百蕊草藥材收錄到其中，但僅從藥材性狀上進(jìn)行控制，在使用過(guò)程中往往是原藥材或粗提入藥有效成分含量低，由于沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，缺乏相應(yīng)的評(píng)價(jià)體系，從而影響了這一傳統(tǒng)中草藥治療作用的發(fā)揮。因此，筆者選擇百蕊草素I作為指標(biāo)性成分并對(duì)其特征圖譜進(jìn)行研究，進(jìn)而為百蕊草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)［7－8］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLC高效液相色譜儀:沃特斯公司;色譜工作站:Masslynx工作站:沃特斯公司 ;色譜柱:Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);FA314 型電子天平(上海?？惦娮觾x器廠)。指紋圖分析軟件:中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)。

1.2 試劑與試藥 乙腈為色譜試劑，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。對(duì)照品:百蕊草素Ⅰ(購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào):MUST－13112210含量為99.45%)。百蕊草藥材:共收集安徽、河南、湖北三省10批百蕊草藥材，均是以白茅為寄主，野生的百蕊草，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，均為檀香科植物百蕊草(Thesium Chinense Turcz.)。見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，以乙腈(A)—0.2%甲酸(B)為流動(dòng)相，按表(2)進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，柱溫35℃，流速 0.4 mL·min－1，進(jìn)樣體積 2.0 μL，見(jiàn)表2。

表2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取百蕊草素Ⅰ對(duì)照品11.81 mg置20 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度，即可。

2.2.2 供試品溶液制備 取百蕊草藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率為40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀［9－10］。

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別按“2.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定供試品中各色譜峰的保留時(shí)間，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于1.0%，實(shí)驗(yàn)表明:本法重現(xiàn)性良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，分別按2.1項(xiàng)下的方法測(cè)定供試品中各色譜峰的保留時(shí)間，其RSD均小于1.0%，實(shí)驗(yàn)表明:本法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新制備的供試品溶液，立即注入液相色譜儀，并每隔一定時(shí)間測(cè)定一次峰面積，直至45 h。其相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于1%，峰面積在45 h內(nèi)的RSD均小于1.0%。實(shí)驗(yàn)表明:本法重復(fù)性良好。

2.4 樣品測(cè)量結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3 10批樣品色譜峰相對(duì)保留時(shí)間(min)

2.5 特征圖譜的建立 取收集到的10批百蕊藥材，分別按上述供試品溶液制備方法制成供試品溶液，再取百蕊草素Ⅰ對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀測(cè)定，10批百蕊草藥材測(cè)定所得色譜圖，輸入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A中，分析處理，共12個(gè)共有峰，選擇其中4個(gè)作為特征峰。與參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±8%之內(nèi)。相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值為:0.52(峰 1)、1.00(峰 S)、1.18(峰2)、2.09(峰3)，見(jiàn)圖1、2。

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道其主要化學(xué)成分為黃酮類化合物，因此現(xiàn)有的百蕊草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以測(cè)定百蕊草總黃酮的含量來(lái)控制藥材以及制劑的內(nèi)在質(zhì)量。通過(guò)文獻(xiàn)研究以及我們的實(shí)驗(yàn)表明，黃酮類類化合物有兩個(gè)吸收峰，分別位于265 nm以及347 nm附件，因此吸收波長(zhǎng)的選擇上，265 nm和347 nm均可，考慮到265 nm吸光度更強(qiáng)，取265 nm作為指紋圖的采集波長(zhǎng)(圖3)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 文獻(xiàn)記載一般采用甲醇—磷酸系統(tǒng)，考慮到特征圖譜HPLC分離系統(tǒng)兼容LCMS特征圖譜輔助定性分析，極性流動(dòng)相部分，采用了甲酸水系統(tǒng)。

3.3 樣品處理方法的選擇 首先對(duì)提取溶劑的種類(100%甲醇、60%甲醇30%甲醇)，其次是提取方法(超聲提取和加熱回流)，最后是提取時(shí)間(15、30、45 min)對(duì)色譜圖的影響。最后確定最佳樣品處理方法為取百蕊草藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率為40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液，即得。

4 結(jié)論

本文以百蕊草藥材為研究對(duì)象，以百蕊草素I為對(duì)照品作為百蕊草中測(cè)定總黃酮的含量指標(biāo)，對(duì)安徽、河南和湖北等三個(gè)產(chǎn)地10批的百蕊草藥材進(jìn)行研究，建立了百蕊草藥材的HPLC特征圖譜，為百蕊草藥材質(zhì)量控制提供了有效的分析方法。同時(shí)對(duì)其主要有效成分百蕊草素Ⅰ進(jìn)行了含量測(cè)定，為中藥制劑的質(zhì)量控制提供了良好的分析方法。為未來(lái)合理、有效地利用百蕊草資源提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也可用于制藥企業(yè)以及藥品監(jiān)管部門(mén)對(duì)百蕊草藥材的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)。

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