吳 強，劉 偉，何廣衛(wèi)

(合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，安徽合肥 230601)

谷氨酰胺是一種非必需氨基酸，經(jīng)腸內(nèi)或腸外補充谷氨酰胺可改善動物的器官功能和生存率［1－2］。但口服谷氨酰胺制劑含量少、胃腸道功能障礙病人吸收差，同時谷氨酰胺水溶性差、熱壓滅菌及長期儲存時在化學上不穩(wěn)定，故谷氨酰胺雙肽作為谷氨酰胺供體的注射劑應運而生，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)就是其中之一［3］。此類藥物的臨床使用劑量很大，如本品的單次使用劑量為20 g，故有關物質(zhì)的定性檢測顯得更為重要。此類藥物常見的檢驗方法是反相高效液相色譜法［4－6］，但通常需衍生化;或采用氨基柱［7－10］進行分析;本品藥典標準［11］亦采用氨基柱進行分離，標準重視了降解產(chǎn)物的研究，對工藝雜質(zhì)(非環(huán)合類雜質(zhì))研究相對較少，特定雜質(zhì)的檢測不及本研究豐富。本文采用陽離子交換色譜法，具有簡單方便，專屬性強等優(yōu)點，避免了非環(huán)合類雜質(zhì)的干擾。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀。L-焦谷氨酸(LPyr-OH)購自上海源聚生物科技有限公司，L-焦谷氨酰-L-丙氨酸(Pyr-Ala-OH)、環(huán) L-丙氨酰-L-谷氨酸［Cyclo(-Ala-Glu)］、環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)［Cyclo(-Ala-Gln)］、L-丙氨酰-L-谷氨酸(L-Ala-LGlu)、D-丙氨酰-L-谷氨酰胺(D-Ala-L-Gln)均購自瑞士BACHEM AG公司，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺由合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司提供，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液(商品名:力太)由無錫華瑞制藥有限公司生產(chǎn)。硫酸(分析純)。

2 方法的建立和驗證

2.1 環(huán)合類有關物質(zhì)的歸屬 氨基酸和肽類物質(zhì)的主要降解途徑為環(huán)合和水解，通過分離預試驗對樣品的檢測，結合本品結構和相關文獻，并以對照品進行比對，分析得出本品的主要環(huán)合類有關物質(zhì)包括:(1)L-焦谷氨酸，為L-谷氨酰胺在酸性條件下自身環(huán)合生成［3］;(2)環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，為二肽熱破壞生成的環(huán)縮二氨酸［12］;(3)環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)，為環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)在堿性加熱條件下酰胺水解生成;(4)L-焦谷氨酰-L-丙氨酸，為 L-焦谷氨酸與 L-丙氨酸縮合產(chǎn)物。

2.2 色譜條件 色譜柱:Hypersil SCX柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:0.000 5 mol·L－1硫酸溶液;流速:0.6 mL·min－1;檢測波長:215 nm。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 各成分的分離情況 (1)非環(huán)合類有關物質(zhì)考察:分別取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、D-丙氨酰-L-谷氨酰胺(異構體)、L-丙氨酰-L-谷氨酸(水解物，非環(huán)合類有關物質(zhì))、L-谷氨酰胺(合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的起始原料)及D-2-氯丙酰-L-谷氨酰胺(合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的唯一中間體)進樣分析，除 D-2-氯丙酰-L-谷氨酰胺外(tR=5.7 min)，其余組份在10 min內(nèi)均無色譜峰出現(xiàn)(上述組份可通過反相離子對色譜分離，環(huán)合類有關物質(zhì)不干擾測定)。(2)環(huán)合類有關物質(zhì)考察:L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的保留時間均在10 min內(nèi)，各組份分離良好(圖1 A)，D-2-氯丙酰-L-谷氨酰胺(tR=5.7 min)不干擾測定。

2.3.2 破壞性試驗考察 由于環(huán)合類有關物質(zhì)的產(chǎn)生多數(shù)與溫度有關［14］，故破壞性試驗主要進行了熱破壞樣品的制備。取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺適量，置測熔點用毛細管中，用熔點儀加熱至230℃后，用水溶解并稀釋制成2 g·L－1的溶液，進樣分析，圖譜顯示(圖1 B)，熱破壞樣品的主要環(huán)合類降解產(chǎn)物為環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，其余降解物質(zhì)也有少量的生成，各降解峰與主藥峰分離良好。

2.3.3 市售品考察 同時通過對市售力太注射液進行檢測，結果顯示(圖1 C)經(jīng)制劑工藝環(huán)合類有關物質(zhì)顯著增加，主要為L-焦谷氨酰-L-丙氨酸和環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。

2.4 檢測限 按信噪比3∶1計，L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的檢測限均約為2 ng(0.1 mg·L－1×20 μL)，結合供試品溶液濃度及相關限度，本方法供試品溶液的配制濃度及方法靈敏度滿足檢測要求。

2.5 線性關系考察 取 L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)對照品，分別考察其線性關系，各組份色譜峰面積與濃度的回歸方程見表1，各組份在相應范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.6 進樣精密度 取各對照品溶液(約5 mg·L－1)，重復進樣6次，計算L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)各組份6次主峰面積的RSD值分別為 0.91%、1.36%、0.67%、0.73%，精密度良好。

表1 線性關系考察試驗結果(n=5)

2.7 準確度 取同一批L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液9份，分別定量加入環(huán)合類雜質(zhì)混合標樣(低、中、高各3份)，制成供試品溶液，按上述方法測定，計算回收率。L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的回收率 分別 為 101.6%、96.58%、97.30%、98.62%，方法準確度可靠。

2.8 重復性試驗 取同批力太注射液，共6份，依法測定，相關檢測結果的RSD值0.92% ～1.75%(n=6)。

2.9 穩(wěn)定性試驗 供試品溶液制備好后，每隔2 h測定1次，結果顯示8 h內(nèi)溶液的穩(wěn)定性良好，RSD值0.84% ～1.26%(n=5)。

3 樣品測定

取市售力太注射液適量，加水稀釋制成2 g·L－1的溶液，作為供試品溶液;另分別精密稱取L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)對照品適量，加水分別溶解并稀釋成10 mg·L－1的對照溶液。取供試品溶液、對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品圖譜如顯雜質(zhì)峰，分別測量供試品溶液色譜圖上各環(huán)合產(chǎn)物的峰面積，按外標法計算供試品中各雜質(zhì)含量。

結果顯示，市售力太注射液(批號:80GC084)含L-焦谷氨酸、L-焦谷氨酰-L-丙氨酸、環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酸)和環(huán)-(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)分別為0.11%、0.36%、0.02%和 0.82%。

4 討論

4.1 流動相的選擇 氨基酸以陽離子形式存在時，就可與陽離子交換樹脂的磺酸交換基的負電荷相互作用。流動相的酸度越高，以陽離子形式存在的氨基酸濃度就越大，此時氨基酸在陽離子交換樹脂固定相中的保留很強。故流動相的選擇通過對流動相硫酸濃度調(diào)整(0～0.007 5 mol·L－1)考察各物質(zhì)及溶劑(水)的分離行為，結果見表2。最終選擇了0.000 5 mol·L－1的硫酸溶液為流動相。

表2 硫酸濃度對分離度的影響

4.2 注射液的制備及貯存 鑒于上述研究結果，在本品注射液制備過程中應盡量降低滅菌溫度和縮短滅菌時間，或開發(fā)成注射用粉針，樣品的貯存也應盡量置于低溫保存。

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