葉 翀，李 俊，徐 濤，蘇 涌

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥 230022)

環(huán)孢素A(Cyclosporine A，CsA)是一種選擇性作用于T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)效免疫抑制劑，主要用于預(yù)防移植術(shù)后的移植物抗宿主反應(yīng)或治療多種自身免疫病。CsA治療指數(shù)窄，治療劑量下生物利用度和體內(nèi)代謝的個(gè)體差異較大，同多種藥物具有相互作用，能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。CsA的不良反應(yīng)有:腎功能損害、膽紅素升高、高血壓、高血糖、頭痛、多毛、牙齦增生、脆甲、痤瘡、惡心、嘔吐、低鎂血癥、癲癇等［1］。作為移植物抗宿主病(GVHD)［2］預(yù)防方案的藥物之一，CsA的合理應(yīng)用，尤其是其血藥濃度與干細(xì)胞移植患者療效及不良反應(yīng)的相關(guān)性研究非常重要［3-4］?，F(xiàn)使用高效液相色譜法(HPLC)［5-8］對我院2012—2014年間所進(jìn)行的44例allo-HSCT患者635例次CsA血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測并對結(jié)果予以分析，為更好地開展CsA濃度監(jiān)測和臨床工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters alliance高效液相色譜儀(配備e2695 separation module，E10 SMH614G 柱溫箱，2489UV/Visible檢測器)，Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5μm);高速冷凍離心機(jī) (長沙平凡儀器公司);AB135-5電子天平(上海梅特勒多-托利多公司);XW-80A渦旋振蕩器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);氮?dú)獯蹈蓛x(PGC-13D)。

1.2 試劑 環(huán)孢素A標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司，59865-13-3);環(huán)孢素D標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司，63775-96-2);乙腈(色譜純，Tedia公司);甲醇(色譜純，Tedia公司);叔丁基甲醚(分析純，Tedia公司);正己烷(分析純，Tedia公司);氫氧化鈉(分析純);鹽酸(分析純);超純水。

1.3 色譜條件 流動相:乙腈∶水=85∶15;檢測波長:214 nm;流速:1.2 mL·min-1;柱溫:65℃;進(jìn)樣量:20μL。

1.4 溶液配制

1.4.1 環(huán)孢素A工作液配制 精密稱取環(huán)孢素A 10 mg，至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋溶解至刻度混勻，得1 000 mg·L-1的環(huán)孢素A儲備液Ⅰ。再精密量取環(huán)孢素A儲備液Ⅰ1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻，得100 mg·L-1的環(huán)孢素A儲備液Ⅱ。再精密量取環(huán)孢素A儲備液Ⅱ2.5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻，得25 mg·L-1的環(huán)孢素A工作液。

1.4.2 環(huán)孢素D工作液配制 精密稱取環(huán)孢素D 10 mg，至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度混勻，得1 000 mg·L-1的環(huán)孢素D儲備液Ⅰ。再精密量取環(huán)孢素D儲備液Ⅰ1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻，得100 mg·L-1的環(huán)孢素D儲備液Ⅱ。再精密量取環(huán)孢素D儲備液Ⅱ5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度混勻，得50 mg·L-1的環(huán)孢素D工作液。

1.4.3 氫氧化鈉溶液配制 精密稱取氫氧化鈉固體2 g，至500 mL容量瓶中，加水至刻度混勻，得0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液。

1.4.4 鹽酸溶液的配制 精密量取濃鹽酸4 mL至500 mL容量瓶中，加水至刻度混勻，得0.1 mol·L-1的鹽酸溶液。

1.5 樣品預(yù)處理 取全血樣品1 mL于15 mL具塞試管中，加內(nèi)標(biāo)工作液(環(huán)孢素D)10μL，0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 mL，渦旋混合2 min;加入叔丁基甲醚1.5 mL，渦旋混合2 min，離心(3 000 r·min-1)10 min，取上層醚液(重復(fù)兩次萃取);將上層有機(jī)相置于55℃水浴中氮?dú)獯蹈?加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液和50μL流動相復(fù)溶，渦旋混合2 min;加入500 mL正己烷，渦旋混合2 min，離心(6 000 r·min-1)10 min，棄去正己烷層，取下層試樣20μL進(jìn)樣。

1.6 樣本納入標(biāo)準(zhǔn) (1)患者年齡均大于15歲。(2)2012—2014年于我院血液內(nèi)科首次進(jìn)行造血干細(xì)胞移植的患者。(3)患者移植前3 d開始接收CsA治療，移植前1 d使CsA血藥濃度達(dá)到200～400μg·L-1。(4)檢測濃度均為移植后6個(gè)月內(nèi)［4］。

2 結(jié)果

2.1 色譜分離 按照上述色譜條件進(jìn)行測定，CsA和內(nèi)標(biāo)CsD峰形良好，CsA保留時(shí)間約為5.3 min，CsD保留時(shí)間約為6.2 min。見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 配制濃度為 50、100、250、400、500、800、1 000 μg·L-1的 CsA 溶液，分別加入1 mL空白全血中，按1.5方法下進(jìn)行樣品預(yù)處理后進(jìn)樣，以CsA濃度為橫坐標(biāo)(μg·L-1)，CsA與CsD比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程Y=0.003X-0.0293，R2=0.999 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 分別配制250、500、800μg·L-1三個(gè)濃度的CsA溶液，分別加入1 mL空白全血中，按“1.5”方法下進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣，各濃度每小時(shí)進(jìn)一針，連續(xù)進(jìn)5 h。連續(xù)5 d進(jìn)行以上各濃度的進(jìn)樣操作。各濃度CsA與CsD峰面積比為M，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，精密度RSD(%)=(SD/M)×100%。結(jié)果見表1，高中低三個(gè)濃度的日內(nèi)RSD和日間RSD均小于10%，表明此方法精密可重現(xiàn)，可用于樣品測定。

表1 環(huán)孢素A精密度實(shí)驗(yàn)(n=5，±s)

表1 環(huán)孢素A精密度實(shí)驗(yàn)(n=5，±s)

濃度 C/μg·L-1日內(nèi)精密度SCsA/SCsD SD RSD/%日內(nèi)精密度SCsA/SCsD SD RSD/%250 0.78 ±0.01 0.013 1.64 0.76 ±0.02 0.024 3.16 500 1.47 ±0.02 0.017 1.16 1.44 ±0.05 0.054 3.74 800 2.45 ±0.04 0.038 1.57 2.41 ±0.07 0.071 2.93

2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 分別配制250、500、800μg·L-1三個(gè)濃度的CsA溶液各5份，分別加入1 mL空白全血中，按“1.5”方法下進(jìn)行前處理后進(jìn)樣，將結(jié)果帶入線性方程中，計(jì)算濃度C1，計(jì)算C1與標(biāo)準(zhǔn)濃度C的比值，即為方法回收率或相對回收率。

分別配制 250、500、800 μg·L-1三個(gè)濃度的CsA溶液各5份，分別加入1 mL空白全血中，按“1.5”方法下進(jìn)行前處理后進(jìn)樣，得到結(jié)果CsA峰面積S1;另用流動相分別配制 250、500、800 μg·L-1三個(gè)濃度的CsA溶液，直接進(jìn)樣，得到結(jié)果CsA峰面積S。計(jì)算S1/S的比值，即為提取回收率或絕對回收率。見表2。

表2 環(huán)孢素A回收率實(shí)驗(yàn)(n=5，±s)

表2 環(huán)孢素A回收率實(shí)驗(yàn)(n=5，±s)

濃度 C/μg·L-1相對回收率C1/μg·L-1 C1/C×100/%絕對回收率S S1 S/S1×100/%250 254.54 ±2.44 101.82 ±0.97 26.23 ±0.51 28.592.05 ±1.80 500 491.39 ±4.45 98.14 ±0.98 52.50 ±1.21 57.2 91.78 ±2.12 800 773.17 ±10.88 96.65 ±1.37 93.97 ±3.04 99.694.34 ±3.05

2.5 樣品檢測 共測得符合納入標(biāo)準(zhǔn)患者44例，累計(jì)檢測環(huán)孢素濃度635例次。男性30例，女性14例;9例為中華骨髓庫無血緣關(guān)系外周血干細(xì)胞供體，5例為臍血干細(xì)胞供體，其余30例為患者同胞外周血干細(xì)胞供體。

2.6 CsA濃度分布 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道CsA有效血藥濃度在200 ～400 μg·L-1之間［9］，所監(jiān)測的 allo-HSCT患者CsA血藥濃度結(jié)果分布見表3。

表3 CsA濃度分布

2.7 CsA濃度與移植物抗宿主病(GVHD)的關(guān)系將患者CsA平均血藥濃度值分為兩組，＜200μg·L-1和≥200 μg·L-1，以 χ2檢驗(yàn)兩組與發(fā)生GVHD概率的相關(guān)性。44例患者在移植后6個(gè)月內(nèi)有19例患者出現(xiàn)GVHD反應(yīng)，其中皮疹10例，口腔黏膜炎7例，腹瀉2例。分組比較發(fā)現(xiàn)，平均血藥濃度＜200μg·L-1的患者發(fā)生GVHD的概率大于平均血藥濃度＞200μg·L-1的患者組，χ2檢驗(yàn)P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表4。

表4 CsA濃度與GVHD發(fā)生率的關(guān)系

2.8 CsA濃度與藥品不良反應(yīng)(ADR)的關(guān)系 將患者CsA平均血藥濃度值分為兩組，＜400μg·L-1和≥400μg·L-1，以 χ2檢驗(yàn)兩組與發(fā)生 ADR概率的相關(guān)性。44例患者在移植后6個(gè)月內(nèi)發(fā)生疑似CsA藥物性ADR 3例，都為肌酐升高和轉(zhuǎn)氨酶升高的肝腎功能損傷，減量或停藥后可恢復(fù)。分組比較發(fā)現(xiàn)血藥濃度 ＜400μg·L-1的患者組發(fā)生ADR概率小于血藥濃度＞400μg·L-1的患者組，χ2檢驗(yàn)P＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表5 CsA濃度與ADR發(fā)生率的關(guān)系

3 討論

全血CsA濃度檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和熒光偏振免疫法(FPIA)［10-11］。FPIA法需要血藥濃度檢測儀(TDX)和試劑盒，價(jià)格較為昂貴，有效期短，以進(jìn)口為主;而本法所需高效液相色譜儀相對較為普及，大多醫(yī)療機(jī)構(gòu)都有，便于推廣應(yīng)用。此外，由于本法測定成本低，減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)建立的全血CsA濃度HPLC測定方法，重現(xiàn)性好、提取回收率高、變異系數(shù)小。本方法除本文已收納病例外，3年來共檢測全血環(huán)孢素濃度2 000余次，取得了良好的結(jié)果。本方法簡便、可行，可以廣泛的用于臨床血藥濃度監(jiān)測。

本文研究結(jié)果顯示，接受allo-HSCT患者中，不同個(gè)體不同時(shí)期對CsA的敏感性和耐受性差異較大，臨床上應(yīng)密切監(jiān)測CsA血藥濃度，以防止?jié)舛冗^低發(fā)生相關(guān)的移植物抗宿主病或濃度過高發(fā)生的藥品相關(guān)不良反應(yīng)。在行allo-HSCT時(shí)，應(yīng)盡量使患者的CsA血藥濃度維持在200～400μg·L-1范圍內(nèi)［12］。

本研究涉及一家三甲醫(yī)院三年的Allo-HSCT患者，樣本量相對較少，只能就已知樣本初步研究CsA藥物濃度與患者出現(xiàn)GVHD、ADR之間的相關(guān)性。今后的研究中，還可以根據(jù)GVHD、ADR出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)討論CsA濃度與術(shù)后各時(shí)間段的相關(guān)性，以及根據(jù)急性 GVHD的分級，研究 CsA濃度高低與GVHD各分級的相關(guān)性。其他研究還可包括CsA用藥劑量與濃度相關(guān)性，術(shù)前預(yù)處理方案與CsA濃度相關(guān)性，術(shù)后造血重建時(shí)間與CsA濃度相關(guān)性等［13-14］。

［1］Borel JF.The cyclosporines［J］.Transplant Proc，1989，21:810-816.

［2］丁 琪，蒲曉彥，宋麗潔，等.異基因造血干細(xì)胞移植后并發(fā)癥的分析［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2012，21(5):543-545.

［3］朱康爾，徐 碭，吳 東，等.異基因外周血干細(xì)胞移植治療白血病的臨床研究［J］.中華內(nèi)科雜志，2001，40(2):117-119.

［4］宋麗麗，陳東生，呂永寧.環(huán)孢素血藥濃度監(jiān)測方法比較［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27(2):210-212.

［5］錢雅靜，章衛(wèi)平，王健民，等.異基因外周血干細(xì)胞移植術(shù)后監(jiān)測環(huán)孢素A血濃度的臨床意義［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(9):1037-1038.

［6］廖 蕓，沈友軒.高效液相色譜法測定環(huán)孢素A血藥濃度［J］.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，49(5):54-58.

［7］趙駐軍，張翠欣，李 亞.高效液相色譜法檢測人全血環(huán)孢素A 濃度［J］.河北醫(yī)藥，2006，28(10):995-996.

［8］張 婷.HPLC法準(zhǔn)確測定環(huán)孢素A的血藥濃度［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21(10):1095-1096.

［9］Rogosheske JR，F(xiàn)argen AD，De For TE，et al.Higher therapeutic CsA levels early post transplantation reduce risk of acute GVHD and improves survival［J］.Bone Marrow Transplantation，2014，49(1):122-125.

［10］陶興茹，連秋艷，戴 映，等.高效液相色譜法與熒光偏振免疫法測定人全血環(huán)孢素A濃度的比較［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2013，22(2):195-199.

［11］廉江平，李小川，張 鵬.EMIT與FPIA法測定腎移植術(shù)后患者體內(nèi)環(huán)孢素A血藥濃度結(jié)果比較［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(12):2039-2041.

［12］孫言才，劉會蘭，孫自敏，等.異基因造血干細(xì)胞移植患者全血中環(huán)孢素A濃度的監(jiān)測分析［J］.安徽醫(yī)藥，2006，10(1):35-37.

［13］粱立艷，張鳳奎.環(huán)孢素的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)臨床意義的研究進(jìn)展［J］.中華血液學(xué)雜志，2011，32(4):284-286.

［14］李純璞，李斑斑，滕清良，等.環(huán)孢素A在再生障礙性貧血及異基因造血干細(xì)胞移植中的有效血藥濃度檢測的影響因素［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2014，8(1):128-131.