金媛媛，胡靜，馮璐，李楊，陳燁鋆，胡曉松，李帥

局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)血管單元的空間構(gòu)筑①

金媛媛1a，胡靜1a，馮璐1a，李楊1a，陳燁鋆1a，胡曉松1b，李帥1b

目的研究局灶性腦缺血不同再灌注時(shí)間段大鼠腦血管、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的空間構(gòu)筑。方法24只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=8)和模型組(n=16)，模型組再平均分為再灌注1 d和2周兩個(gè)亞組。線栓法大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞1 h后再灌注。各組活體灌注明膠墨汁。按時(shí)間取腦組織冰凍連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)法觀察膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元核心抗原(NeuN)的表達(dá)。結(jié)果血管在皮質(zhì)或神經(jīng)核等處分布較多，多數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞突起與血管及神經(jīng)元接觸。模型組缺血側(cè)GFAP表達(dá)較假手術(shù)組持續(xù)增多，NeuN表達(dá)減少。再灌注1 d缺血側(cè)血管數(shù)目明顯減少，再灌注2周后增多，但仍低于假手術(shù)組及非缺血側(cè)。結(jié)論觀察到腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)血管單元的構(gòu)筑。

局灶性腦缺血；再灌注；神經(jīng)血管單元；空間構(gòu)筑；大鼠

[本文著錄格式]金媛媛，胡靜，馮璐，等.局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)血管單元的空間構(gòu)筑[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2015,21(1):31-34.

CITED AS:Jin YY,Hu J,Feng L,et al.Spatial organization of neurovascular unit after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats[J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):31-34.

由神經(jīng)元及其相關(guān)的膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等組成的功能單元，被稱之為“神經(jīng)血管單元”(neurovascular unit,NVU)。NVU是美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病學(xué)與卒中研究所(National Institute of Neurological Disorders and Stroke,NINDS)2002年提出的腦卒中治療的概念模型[1]，這個(gè)概念將血管、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用看作一個(gè)整體進(jìn)行研究。腦缺血后，隨著多種炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)生血腦屏障受損、通透性增大，神經(jīng)元變性壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生等一系列復(fù)雜的病理變化。為了解作為結(jié)構(gòu)功能一體化的NVU空間構(gòu)筑改變，本研究采用線栓法制作大腦中動(dòng)脈閉阻(MCAO)模型[2]，通過(guò)明膠墨汁灌注、免疫組化等方法觀察腦血管、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元時(shí)空變化情況。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量(250± 40)g，雌雄不拘，由四川達(dá)碩生物有限公司提供。兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)、小鼠抗大鼠神經(jīng)元核心抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)：美國(guó)ABCAM公司。Polymer雙染檢

測(cè)試劑盒、兔二抗PV6001、鼠二抗PV6002：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)后，用Excel隨機(jī)數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注1 d和2周模型組，每組8只。

1.3 模型制備

大鼠術(shù)前禁食12 h，稱重。3.6%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉。仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。取頸正中切口，逐層切開(kāi)暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈結(jié)扎的遠(yuǎn)心端剪一小口，刺入浸于2.5×106U/L肝素鈉的長(zhǎng)5 cm、直徑0.26 mm、頭端圓鈍的尼龍線，經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈約(19.0±0.5) mm，輕微遇阻即止。固定尼龍線并全層縫合切口。1 h后抽出尼龍線實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組插入尼龍線長(zhǎng)度10 mm，其他步驟同模型組。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

麻醉清醒后，采用Longa法[5]對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，判斷模型是否成功。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，爬行時(shí)出現(xiàn)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。將評(píng)分為1～2分的大鼠納入模型組。

1.5 墨汁灌注與取材

動(dòng)物按預(yù)定再灌注時(shí)間腹腔注射過(guò)量3.6%水合氯醛。仰臥位固定，剪開(kāi)腹壁，暴露并剪開(kāi)膈肌，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟。用眼科剪在心尖處剪一切口，將灌注針插入左心室，并于右心耳處剪一小口。向主動(dòng)脈方向灌入37℃生理鹽水，直至右心耳流出清亮的液體。經(jīng)左心室在大鼠平均動(dòng)脈壓下灌注37℃含3%明膠的墨汁20 ml；再在180%大鼠平均動(dòng)脈壓下灌注含5%明膠的37℃墨汁30 ml。結(jié)扎主動(dòng)脈，將大鼠立即放于4℃冰箱中2 h，以利于明膠凝固，防止墨汁流失。用組織剪將大鼠頸部剪開(kāi)，咬骨鉗咬開(kāi)顱骨，完整取出大腦，立即置于-80℃冰箱中保存待檢。

腦組織從冰箱中取出，置10%中性甲醛液固定24 h，再浸入30%蔗糖溶液中，常溫下至標(biāo)本沉底(防止冰晶形成)。-15℃恒冷連續(xù)冰凍切片，片厚5 μm，每隔5張取1張，吹干后置-80℃冰箱中保存。

1.6 免疫組化雙標(biāo)記法

采用Envision二步法進(jìn)行。切片加入梯度乙醇浸水，0.01 mol/L PBS液(pH=7.2)洗3次，每次3 min，高壓修復(fù)4 min；PBS洗3次。加入3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS洗3次；羊血清封閉，滴加GFAP(1∶500)和NeuN(1∶200)一抗4℃冰箱過(guò)夜；復(fù)溫，PBS洗3次，滴加二抗，37℃恒溫箱中40 min，PBS洗3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封片。

1.7 免疫雙染檢測(cè)法

一抗GFAP、NeuN分別按1∶250和1∶100稀釋，嚴(yán)格按雙染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行冰凍切片染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血管

再灌注1 d，模型組缺血側(cè)紋狀體區(qū)血管數(shù)較假手術(shù)組及非缺血側(cè)明顯減少(P＜0.01)，并且觀察到部分血管通透性增高；再灌注2周，缺血側(cè)紋狀體區(qū)血管數(shù)較假手術(shù)組及非缺血側(cè)減少(P＜0.05)，但較再灌注1 d時(shí)增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組紋狀體區(qū)血管數(shù)比較(n)

2.2 免疫組化

假手術(shù)組觀察到NeuN在神經(jīng)元胞核和胞漿中表達(dá)。再灌注1 d，缺血側(cè)NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組及非缺血側(cè)明顯減少(P＜0.01)；再灌注2周，缺血側(cè)NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組及非缺血側(cè)明顯減少(P＜0.01)。見(jiàn)表2。2周時(shí)，部分缺血中心區(qū)可見(jiàn)少量存活NeuN陽(yáng)性細(xì)胞，呈條索狀分布，其內(nèi)常見(jiàn)血管存在(圖1)。

表2 各組NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(n)

假手術(shù)組GFAP陽(yáng)性表達(dá)胞體小，突起細(xì)，數(shù)量少(圖1)。再灌注1 d，缺血側(cè)胼胝體區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組及非缺血側(cè)增加(P＜0.05)；再灌注2周，缺血側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組及非缺血側(cè)明顯增加(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

血管主要分布在皮質(zhì)或神經(jīng)核等處，神經(jīng)元分布密集的區(qū)域血管分布也相對(duì)密集。星形膠質(zhì)細(xì)胞主要分布在血管的周?chē)?。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞突起與神經(jīng)元發(fā)生聯(lián)系，同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞突起末端終足包裹著血管，充當(dāng)神經(jīng)元與血管之間的紐帶與橋梁作用(圖1)。

表3 各組胼胝體GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(n)

圖1 血管、NeuN、GFAP分布

3 討論

NVU的概念強(qiáng)調(diào)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管在結(jié)構(gòu)和功能上的整體性，并且重視不同細(xì)胞成分間的相互作用和相互聯(lián)系。有研究表明，NVU中，星形膠質(zhì)細(xì)胞參與包裹血管壁99%以上面積，并與內(nèi)皮細(xì)胞相互影響和作用，具有增加緊密連接，減少縫隙連接的作用[3]。星形膠質(zhì)細(xì)胞也通過(guò)突起與神經(jīng)元發(fā)生聯(lián)系。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元與血管之間發(fā)揮重要的紐帶與橋梁作用，介導(dǎo)NVU各組分間的相互作用[4]。

本研究觀察到，腦缺血后，多數(shù)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)突起與血管及神經(jīng)元接觸，缺血區(qū)NeuN陽(yáng)性細(xì)胞減少，并隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步減少；同時(shí)缺血區(qū)血管數(shù)減少，并可見(jiàn)明膠墨汁外滲到血管外的血管壁受損情況。此外，在假手術(shù)組及非缺血側(cè)腦組織，血管數(shù)在皮質(zhì)區(qū)最多，CPU區(qū)較少，提示血管分布與神經(jīng)元密度及其相應(yīng)的功能一致[5]。

腦血管在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中扮演重要角色。許多生理和行為會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用明膠墨汁灌注法研究血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化取得了較好的效果[6-7]。明膠屬動(dòng)物蛋白，易溶于溫水，冷卻后形成凝膠，其溶解度與凝固溫度相差很小。明膠墨汁的濃度較高，導(dǎo)致微血管灌注不充分；3%和5%明膠墨汁配合使用，可使血管的各級(jí)分支灌注更充分[8-12]。

本研究觀察到，假手術(shù)組灌注后，腦組織表面黑色分布均勻，而模型組缺血側(cè)明膠墨汁灌注黑色分布較非缺血側(cè)少，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。從灌注的腦組織

的表面觀察，提示應(yīng)用明膠墨汁進(jìn)行灌注時(shí)，明膠墨汁的濃度、溫度、灌注量以及灌注時(shí)壓力大小對(duì)于灌注結(jié)果都有影響。

NVU概念的提出是基于改善脈管系統(tǒng)及其他微環(huán)境成分，以減輕腦卒中、腦損傷和神經(jīng)退行性變而導(dǎo)致的包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞死亡的癥狀。急性缺血性腦卒中可快速觸發(fā)NVU損傷，導(dǎo)致血腦屏障等發(fā)生變化，通過(guò)血腦屏障損傷機(jī)制導(dǎo)致腦水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等繼發(fā)性腦損傷[14]。本研究應(yīng)用明膠墨汁顯示血管、用GFAP/NeuN免疫組化雙標(biāo)記法在同一個(gè)組織切片中同時(shí)標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，較好顯示NVU的空間構(gòu)筑關(guān)系；觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞突起末端終足包裹血管，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞突起與神經(jīng)元發(fā)生聯(lián)系，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元與血管之間起著紐帶與橋梁作用[15]。與其他應(yīng)用類似的研究[7-8,10]相比，本研究行免疫雙標(biāo)染色，更好地顯示血管、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞三者之間的空間關(guān)系。

本研究尚有不足之處。為了清晰觀察細(xì)胞形態(tài)，切片較薄，行免疫組織化學(xué)復(fù)染后，部分纖細(xì)的血管墨汁顯色較淡。可嘗試適當(dāng)增加切片厚度或改善墨汁明膠的比例，在不影響細(xì)胞形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上更好地顯示微細(xì)血管。

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Spatial Organization of Neurovascular Unit after Focal Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

JIN Yuan-yuan,HU Jing,FENG Lu, LI Yang,CHEN Ye-yun,HU Xiao-song,LI Shuai.Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China

Objective To investigate the spatial organization of neurons,blood vessel and astrocytes at different time of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats.Methods 24 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=8),reperfusion 1 day group and reperfusion 2 weeks group.The latter 2 groups were occluded the middle cerebral arteries for an hour and reperfused.All the rats were injected with gelatin ink.The expressions of glial fibrillary acid protein(GFAP)and neuronal nuclear antigen(NeuN)in the brain were observed with immunohistochemistry.Results The vessels located mainly in cortex and nucleus.Most of astrocytes apophysis connected with vessels and neurons.Compared to the sham group,the expression of GFAP increased significantly in ischemic side,and the expression of NeuN decreased 1 day and 2 weeks after ischemia-reperfusion.The vessels decreased in the ischemic side 1 day after cerebral ischemia-reperfusion,and then increased 2 weeks later.Conclusion The organization of neurovascular unit after cerebral ischemia-reperfusion has been observed.

focal cerebral ischemia;reperfusion;neurovascular unit;spatial organization;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.008

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0031-04

2014-08-18

2014-09-19)

成都醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目基金資助(No.CXXS201304)。

1.成都醫(yī)學(xué)院，a.臨床醫(yī)學(xué)系；b.形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川成都市610500。作者簡(jiǎn)介：金媛媛(1991-)，女，河南商丘市人，本科生。通訊作者：胡曉松(1972-)，男，四川廣安市人，碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：腦缺血損傷及修復(fù)研究。E-mail:woodwind@sohu. com。