曹婉 徐菁菁 曹君

摘要：高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）實驗是藥物分析實驗課程的重要組成部分。結(jié)合多年的教學(xué)科研實踐，對學(xué)生的HPLC實驗進行了課堂調(diào)查，并對學(xué)生在稱量、樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備、流動相的配置、色譜柱的安裝與平衡、色譜條件的設(shè)置及運行等方面存在的問題進行了總結(jié)歸納，尋找問題產(chǎn)生的根源，以期進一步改進和完善HPLC實驗教學(xué)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；實驗教學(xué)；學(xué)生問題；教學(xué)建議；藥物分析

中圖分類號：G642.4 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2015）37-0245-02

藥物分析實驗是全國高等醫(yī)藥院校藥學(xué)、化學(xué)專業(yè)實驗教材之一，在培養(yǎng)學(xué)生具有創(chuàng)新能力的復(fù)合型人才中起到舉足輕重的作用，是理論聯(lián)系實際的重要環(huán)節(jié)[1，2]。通過本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生重點掌握滴定法、分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法等各種分析方法及實驗技術(shù)的基本原理在藥物分析中的實際應(yīng)用，同時培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度、良好的操作習(xí)慣，激發(fā)學(xué)生的求知欲望，挖掘?qū)W生的創(chuàng)新潛能，為從事藥品生產(chǎn)與質(zhì)量檢驗、新藥研究開發(fā)、臨床使用及監(jiān)督管理過程中的分析檢驗等工作奠定堅實的基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代社會與科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對各種復(fù)雜樣品分離分析的要求越來越高，藥品質(zhì)量的分析檢測模式發(fā)生了巨大變化，HPLC技術(shù)逐漸成為一個主流的分析方法2。HPLC由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成，適用于分析沸點高、不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物，具有分離效能高、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等特點?；贖PLC法的應(yīng)用特點，本文結(jié)合筆者自身教學(xué)實踐和科研，采用課堂跟蹤調(diào)查的方法對本校學(xué)生在完成HPLC實驗中存在的經(jīng)常性、普遍性問題進行信息采集、問題統(tǒng)計與分析。本文主要從以下幾個方面進行闡述：

一、液相色譜實驗中學(xué)生常見問題

1.稱量。樣品的稱量是HPLC分析前非常關(guān)鍵的一步。正確的稱量，對維護電子天平的計量性能和延長天平的使用壽命是至關(guān)重要的。在樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的稱量之前，電子天平的量程選擇非常重要。分析電子天平的量程通常有萬分之一和十萬分之一兩種選擇。通常，樣品的稱量選擇萬分之一的量程，而標(biāo)準(zhǔn)品的稱量選擇十萬分之一。有的學(xué)生在標(biāo)準(zhǔn)品的稱量時選擇了萬分之一的量程，稱量的結(jié)果出現(xiàn)了偏差。在樣品的稱量時，有的學(xué)生選擇十萬分之一的量程，認(rèn)為結(jié)果會更加準(zhǔn)確，其實沒有必要，因為樣品的稱量的量比較大，達到克（g）級，萬分之一量程足夠保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。在稱量時，有的學(xué)生未采用去皮法，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。在樣品稱量完成后，有的學(xué)生未及時清理稱量盤、關(guān)上分析天平的門、切斷電源、用天平罩蓋好天平，影響儀器的使用和精度。

2.樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置。在進行HPLC分析前，待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備是非常重要的一步。在對樣品加溶液進行超聲或稀釋處理時，有的學(xué)生使用燒杯或量筒進行加液處理，忘記了HPLC是一個精密性要求高的實驗，導(dǎo)致測定結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差。在制備樣品溶液時，有的學(xué)生忘記了對樣品進行過濾或離心處理，很可能堵塞管路及色譜柱，影響儀器的使用和色譜柱壽命。

3.流動相的配置。為保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在HPLC分析中應(yīng)正確配置液相流動相。溶劑的試劑規(guī)格主要有化學(xué)純、分析純、色譜純等幾種級別。有的學(xué)生在試劑級別的選擇上過于隨意，選擇分析純、甚至選化學(xué)純作為流動相，對色譜柱或HPLC儀器造成損害，影響下次實驗的使用。對一些含有緩沖鹽的溶液，有的學(xué)生圖省事，不進行過濾，導(dǎo)致儀器泵壓升高，色譜柱和管路堵塞。對于流動相的水相，應(yīng)選擇超純水新鮮配置，有些學(xué)生竟然選擇用放置許久的蒸餾水，導(dǎo)致基線較大波動，實驗無法進行。

4.色譜柱的安裝與平衡。在色譜柱安裝時，未注意到色譜柱的安裝方向，把色譜柱的進口端和出口端裝反，極大減少色譜柱的壽命。在進行樣品分析前，HPLC色譜柱的平衡至關(guān)重要。有的學(xué)生未用流動相對分析色譜柱進行充分平衡，檢測信號的基線波動過大，無法進行準(zhǔn)確分析。

5.儀器色譜條件的設(shè)置及運行。在液相色譜條件設(shè)置時，流速、柱溫、波長、進樣量等參數(shù)是保證分析結(jié)果成功的關(guān)鍵。有的學(xué)生在實驗時，往往會遺漏一到二個關(guān)鍵參數(shù)。在參數(shù)設(shè)置后，有的學(xué)生比較急，未等到儀器準(zhǔn)備就緒狀態(tài)，匆忙進樣分析，導(dǎo)致操作失敗。

6.實驗數(shù)據(jù)的處理和記錄。有的學(xué)生在HPLC實際操作中對數(shù)據(jù)的記錄和處理出現(xiàn)的問題較多，如對數(shù)據(jù)的含意及相互關(guān)系模糊不清，忽視單位之間的換算、原始數(shù)據(jù)記錄張冠李戴、數(shù)據(jù)的丟失、及未填寫好儀器使用記錄等差錯。

7.實驗報告的書寫。在實驗報告的書寫過程中，樣品和標(biāo)品的前處理過程記錄的過于簡單，含量結(jié)果的計算未有公式和過程，甚至遺漏單位。有的書寫不規(guī)范，字跡過于潦草，漏掉簽名等問題。甚至有些學(xué)生在撰寫報告時，不是根據(jù)自己實驗操作觀察到的現(xiàn)象得出的結(jié)論，而是根據(jù)實驗教材中的相關(guān)理論推導(dǎo)得出結(jié)論，違背了實驗的初衷。

二、液相色譜實驗中學(xué)生常見問題分析

在HPLC實驗教學(xué)過程中，這些普遍問題由于部分學(xué)生課前對實驗內(nèi)容未預(yù)習(xí)，學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力差，對教學(xué)目的不甚了解。有些學(xué)生過分重視藥物分析理論課的學(xué)習(xí)，且實驗課的占分比重較少，實驗成績的高低對最終藥物分析課成績的影響不大，學(xué)生未引起足夠的重視。也有部分學(xué)生對HPLC實驗課缺乏興趣，意識不到HPLC在整個藥物分析領(lǐng)域占有及其重要的地位，HPLC實驗技能的高低是將來找工作成功的重要砝碼。有些學(xué)生的動手能力不強，長期養(yǎng)成一種只看不做的習(xí)慣。HPLC實驗是分組操作，小組成員之間缺乏配合，各自為戰(zhàn)，團隊意識薄弱。有的學(xué)生責(zé)任心不強，做完相關(guān)實驗，忽視試劑、儀器的整理，隨意擺放，影響了其他學(xué)生的實驗進度。有的學(xué)生粗心大意，造成玻璃儀器破損，藥品和標(biāo)樣污染，甚至釀成事故。實驗數(shù)據(jù)的處理和記錄出現(xiàn)的問題主要在于理論基礎(chǔ)不扎實，沒有準(zhǔn)確理解相關(guān)知識，對實驗結(jié)果的處理過于隨意，缺乏核對、驗證、分析。實驗記錄書寫混亂、用詞缺乏準(zhǔn)確性、不規(guī)范，當(dāng)然與自己的語言表達能力也有關(guān)。當(dāng)然，HPLC實驗易出現(xiàn)的問題與老師的教學(xué)方法也密切相關(guān)。有的老師教學(xué)方法死板，缺乏啟發(fā)式、提問式的教學(xué)方式，無法充分調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。對HPLC色譜實驗關(guān)鍵操作講解不突出，不利于學(xué)生對知識的學(xué)習(xí)和掌握，缺乏對實驗全程的有效監(jiān)督和指導(dǎo)。

三、液相色譜實驗中教學(xué)改進建議

首先，學(xué)生在HPLC實驗課前，應(yīng)充分預(yù)習(xí)，先熟悉色譜基本理論知識，例如分離度、理論踏板數(shù)、拖尾因子、外標(biāo)法、面積歸一化法等術(shù)語意義。理出本次實驗的關(guān)鍵點，明確實驗操作時應(yīng)注意的事項，把不清楚的問題記下來，做到心中有數(shù)。當(dāng)然，同學(xué)之間的相互交流也至關(guān)重要，可更好明確實驗的目的和操作過程。在HPLC實驗中，老師要改進教學(xué)方法，豐富教學(xué)內(nèi)容，充分調(diào)動學(xué)生的實驗積極性。同時創(chuàng)造條件讓每個學(xué)生盡可能地多動手，多參與整個實驗過程。代課老師需要具有扎實的色譜理論知識，制定詳細(xì)的實驗內(nèi)容計劃，實驗器材和藥品放置在適合的位置，努力營造能培養(yǎng)學(xué)生動手能力的實驗條件，打造一個規(guī)范化的HPLC教學(xué)實驗室。老師也應(yīng)開展專題講座，做好演示操作，每一步操作都必須認(rèn)真檢查，用正確、規(guī)范的操作去引領(lǐng)學(xué)生。特別對于HPLC實驗中易出現(xiàn)的問題，更應(yīng)逐一剖析，加深學(xué)生的認(rèn)識，盡可能避免下次犯同類錯誤。在本科生中，建立科研助理制度。利用學(xué)生的業(yè)余時間，鼓勵學(xué)生參加教師的科研課題，跟隨高年級本科生和研究生做實驗，取得階段性成果后，及時總結(jié)和表揚。進一步加強他們的觀察思維能力和實驗動手能力，提高學(xué)生的實驗興趣，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。理論聯(lián)系實際，大大提高學(xué)生的實際操作能力，對HPLC實驗的促進大有裨益，同時為將來的就業(yè)做好充分的準(zhǔn)備。在HPLC實驗教學(xué)中，應(yīng)引入多媒體教學(xué)技術(shù)。在以前的實驗教學(xué)中，老師主要依靠板書和講解，對HPLC實驗來說，學(xué)生會感到實驗的枯燥和單調(diào)。多媒體動畫的引入可增加學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，激發(fā)求知欲和好奇心，便于學(xué)生把握實驗的關(guān)鍵操作點。合理的實驗考核機制影響學(xué)生的學(xué)習(xí)效果和教學(xué)質(zhì)量反饋，藥物分析實驗課的評分體系也應(yīng)改進。傳統(tǒng)的HPLC實驗教學(xué)考核往往依靠實驗報告的評定，為一些不認(rèn)真完成實驗、甚至不做實驗的學(xué)生提供了可乘之機。在藥物分析HPLC實驗課考核體系中，應(yīng)設(shè)置詳細(xì)而具體的量化指標(biāo)，如實際到課情況、動手操作能力、實驗報告、筆試、團隊意識等項目均應(yīng)占一定比例，這樣可有效端正學(xué)生的實驗態(tài)度，讓學(xué)生心中有數(shù)，認(rèn)真進行實驗操作，有效提高HPLC實驗課的教學(xué)質(zhì)量。

總之，HPLC實驗是藥物分析實驗課的重要組成部分，是一項操作十分強的科目，又是培養(yǎng)學(xué)生動手能力、創(chuàng)新意識的重要途徑。只有擺脫傳統(tǒng)的教學(xué)模式，創(chuàng)新HPLC實驗教學(xué)內(nèi)容，同時營造一個良好的情感氛圍，全方位提高學(xué)生的實踐能力，適應(yīng)國家對培養(yǎng)高素質(zhì)人才的要求，將學(xué)生培養(yǎng)成優(yōu)秀的醫(yī)藥創(chuàng)新人才。

參考文獻：

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